Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af priser fra National Institute of Mental Health (R01MH110438) og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) til AV.

1. Kultur og opbevaring af humane periventrikulære endotelceller
<ol><li>Vedligehold humane periventrikulære endotelceller på kældermembranmatrixbelagte (se Tabel over materialer) 6-brøndspladeri periventrikelendotelcellemedium (E6-medium, der indeholder 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 og 5 μM GABA) ved 37 °C og 5% CO2. Skift medium hver alternativ dag.</li>
	<li>Tø kældermembranmatrix i 4 °C, og lav en 1:100 opløsning ved at fortynde den i koldt DMEM/F12-medium. Coat hver brønd ...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

Her beskrev vi tre in vitro-analyser, der tilsammen giver en kvantitativ vurdering af humane periventrikulære endotelcellespecifikke egenskaber. Disse analyser vil være værdifulde i at få mekanistisk indsigt i samspillet mellem menneskelige periventrikel endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter, der anvender ligander, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller overekspression, vil identificere eller validere molekylære afspillere, der formidler endotelcellestyret interneuronmigration...

Endotelceller danner foring af blodkar og mægle vigtige funktioner, der omfatter vedligeholdelse af fartøjets væg permeabilitet, regulering af blodgennemstrømningen, blodplade sammenlægning, og dannelse af nye blodkar. I hjernen, endotelceller udgør en del af en kritisk blod - hjerne-barriere, der stramt styrer udveksling af materialer mellem hjernen og blodbanen1. Vores undersøgelser i det seneste årti har identificeret nye neurogene roller hjerne endotelceller, der har betydelige konsekvenser for hjernens udvikling og adfærd2,3,4,5. Vi har vist, at musen embryonale forhjernen er vaskulariseret af to forskellige undertyper af fartøjer, pial fartøjer og periventrikulære fartøjer, der adskiller sig i anatomi, oprindelse, og udviklingsmæssige profil2. Endotelceller foring disse to fartøjsundertyper viser tydelige forskelle i deres genekspressionsprofiler. Mens pial endotelceller meste udtrykke gener relateret til betændelse og immunrespons, periventrikel endotelceller er unikt beriget i udtryk for gener, der almindeligvis er forbundet med neurogenese, neuronal migration, kemotaxis, og axon vejledning3. Periventtricular endotelceller også hus en roman GABA signalering vej, der adskiller sig fra den traditionelle neuronale GABA signalering vej5. Samtidig med sit genudtryk, periventrikulære endotelceller blev fundet at regulere migration og distribution af GABAergic interneuroner i udviklingslandene neocortex. Under embryonale udvikling, periventrikulære endotelceller gennemgå langdistance migration langs en ventral-dorsale gradient at etablere den periventrikulære vaskulære netværk2,3. Denne migrationsrute afspejles en dag senere af interneuroner. Migrerende interneuroner interagerer fysisk med det præformede periventrikulære vaskulære netværk og bruger det som en guiderail for at nå deres endelige destination i neocortex. Ud over at fungere som et fysisk substrat, periventrikulære endotelceller tjene som kilde til navigationssignaler til migrerende neuroner. Periventrikulære endotelcelleudskillede GABA guider interneuronmigration og regulerer deres endelige distributionsmønstre4. Defekter i interneuron migration og distribution er forbundet med neuropsykiatriske lidelser såsom autisme, epilepsi, skizofreni og depression6,7,8,9,10. Derfor, undersøgelse af periventrikulære endotelcelle funktioner og deres indflydelse på interneuron migration i menneskelig sammenhæng bliver afgørende for at løse patogenesen af disse lidelser.
Vi har genereret humane periventrikulære-lignende endotelceller fra menneskelige embryonale stamceller i vores laboratorium11,ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller (iPSC) teknologi12,13. For at validere, om humane periventrikulære endotelceller trofast efterligner museperiventrikulære endotelceller, og for kvantitativt at vurdere deres indflydelse på interneuronmigration, udviklede vi tre in vitro-analyser: en langdistance-migrationsanalyse, en co-kultur migration assay og en kemo-attraktionsanalyse. Her beskriver vi protokoller for disse analyser i detaljer. Alle tre analyser er baseret på brugen af silikone kultur skær til at skabe en lille rektangulær patch af celler (af faste dimensioner) omgivet af celle-fri rum. Migrationsafstanden evalueres ved at måle afstanden mellem cellernes endelige positioner fra kanten af den rektangulære patch, der er skitseret på dag 0. I den lange afstande migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er seedet som et plaster i midten af en 35 mm fad, og de afstande, der rejses af cellerne over en lang række tid beregnes. I co-kultur migration assay, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seedede med menneskelige interneuroner som en patch i en 35 mm parabol. Denne opsætning gør det muligt at undersøge effekten af direkte fysiske interaktioner af disse to celletyper på hastigheden af migration af interneuroner. Den kemo-attraktion assay måler migration af interneuroner som reaktion på kemo-attraktive signaler udskilles af menneskelige periventtricular endotelceller. Interneuroner er seedet som en rektangulær plet, med menneskelige periventrikulære endotelceller og kontrol ikke-periventtricular endotelceller seedet som lignende størrelse patches på begge sider. Hver af celleplastrene er adskilt af et cellefrit hul på 500 μm. Reaktion af interneuroner vurderes ved at kvantificere antallet af celler, der er migreret mod periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontrol af ikke-periventrikulære endotelceller.
Disse analyser giver en robust vurdering af humane periventrikulære endotelcellefunktioner og deres indflydelse på interneuronmigration. Den nye opsætning af langdistance-analyse og co-kultur migration assay giver celle-fri plads i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) for at tillade påvisning af langdistance migration. En oversigt over funktionerne i vores analyser i forhold til andre populære analyser er præsenteret i tabel 1. Kollektivt, de analyser, der er beskrevet her vil tjene som en platform for vurdering af "syge" periventrikulære endotelceller og interneuroner genereret fra iPSCs af hjernesygdomme som skizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analyser kan også bruges til at bestemme, hvordan forskellige tilstande (f.eks. hæmmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrationen. Endelig kan disse analyser optimeres til andre celletyper til måling af langdistancemigrering, kemo-tiltrækning eller cellebaseret medieret migrering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

Hjernens vaskulaturs rolle i udviklingen af nervesystemet og ætiologi en hjernesygdom får i stigende grad opmærksomhed. Vores seneste undersøgelser har identificeret en særlig population af vaskulære celler, de periventrikulære endotelceller, der spiller en afgørende rolle i migration og distribution af forhjernen GABAergic interneuroner under embryonaludvikling. Dette, kombineret med deres celle-autonome funktioner, hentyder til nye roller periventrikulære endotelceller i patologi af neuropsykiatriske lidelser som skizofreni, epilepsi, og autisme. Her har vi beskrevet tre forskellige in vitro-analyser, der tilsammen evaluerer periventrikelendotelcellers funktioner og deres interaktion med GABAergic interneuroner. Brug af disse analyser, især i en menneskelig sammenhæng, vil give os mulighed for at identificere forbindelsen mellem periventrikulære endotelceller og hjernesygdomme. Disse analyser er enkle, lave omkostninger, og reproducerbare, og kan nemt tilpasses til enhver tilhænger celletype.

Trinene til opsætning af et etgodt kulturskær inde i en 35 mm skål er vist i figur 1. Langdistance migration assay og co-kultur migration assay brugt en one-well indsætte til frø det ønskede antal celler i midten af en poly-L-ornithin /laminin belagt 35 mm fad. På dag 0 var cellerne til stede som et rektangulært plaster (figur 2A,C). I dag 0 billeder, dag 0 linje kunne nemt identificeres ved den skarpe ka...

Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Vi præsenterer tre enkle in vitro-analyser-den lange afstande migration assay, co-kultur migration assay, og kemo-attraktion assay-at kollektivt evaluere funktionerne i menneskelige stamceller afledt periventtrikulære endotelceller og deres interaktion med GABAergic interneuroner.

Migration, Chemo-Attraction, og Co-Kultur Assays for Human Stem Cell-Afledt endotelceller og GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Denne protokol beskriver tre in vitro-assays, der tilsammen vurderer funktionerne af humane periventrikulære endotelceller og deres interaktion med humane GABAergic interneurons. Resultater fra disse analyser vil give kritisk indsigt i forbindelsen mellem periventrikulære endotelceller og hjernesygdomme. Disse analyser er enkle, billige og tillader måling af cellemigration i området af centimeter, hvilket ikke opnås ved andre eksisterende analyser.Defekter i migration og distribution af GABAergic interneurons er forbundet med psykiatriske lidelser, såsom autisme, epilepsi, skizofreni og depression. Derfor er det afgørende at undersøge samspillet mellem periventrikulære endotelceller med GABAergic interneurons i menneskelig sammenhæng for at løse patogenesen af disse lidelser. Begynd med at forberede menneskelige celler til analysen.Tillad humane periventrikulære endotelceller at nå op på 70 til 80% sammenløb derefter adskille dem i henhold til manuskriptet anvisninger og tælle dem ved hjælp af trypan blå udelukkelse metode. For at forberede menneskelige GABAergic interneurons, varm celle dissociation løsning og en aliquot af neuronal medium ved 37 grader celsius i 10 minutter. Derefter aspirere mediet fra hver brønd, der indeholder celler og vaske dem med en millimeter PBS per brønd.Fjern cellerne ved at tilsætte 0,5 milliliter forkostemt dissociationsopløsning pr. brønd og inkubere dem ved 37 grader celsius i fem minutter. Efter inkubationen tilsættes en milliliter neuronal medium pr. brønd og overføre celleopløsningen til et 15 milliliter konisk rør, der forsigtigt triturerer for at adskille celleklumper. Centrifuge cellerne ved 380 gange G i fem minutter ved stuetemperatur, aspirere supernatant og resuspend cell pellet i en milliliter neuronal medium.Derefter tælle de levende celler ved hjælp af trypan blå udelukkelse. Forbered kontrol menneskelige endotelceller ved opvarmning af celle dissociation løsning og en aliquot af endotel medium ved 37 grader celsius, 10 minutter før brug. Aspirere medium fra hver brønd og vask dem med en milliliter PBS per brønd.Afgræns cellerne ved at tilsætte 0,5 milliliter den forvarmede dissociationsopløsning til hver brønd og inkubere pladen ved stuetemperatur i fem minutter. Derefter tilsættes en milliliter endotelcellemedium pr. brønd for at neutralisere dissociationsopløsningen og overføre cellerne til et 15 milliliter konisk rør. Centrifuge cellerne ved 200 gange G i fem minutter, aspirere supernatant og resuspend cellerne i en milliliter endotelcelle medium.Brug derefter udelukkelsesmetoden for trypan til at tælle cellerne. Forbered en brønd kultur indsætte ved at skære tre sider af en brønd af en to godt silikone kultur indsætte med en steril klinge. Fjern indsatsen med sterile pincet og læg det i midten af en poly-L-ornithin og laminin-belagt fad, og tryk derefter langs kanten af indsatsen for at fastgøre det til overfladen.Vend forsigtigt skålen på hovedet for at kontrollere, at indsatsen sidder fast, og marker skærrummets grænse ved hjælp af et permanent sort marked med en ultrafin spids. Suspendere menneskelige GABAergic interneurons i neuronal medium og menneskelige periventrikulære endotelceller og endotelcellemedium i en koncentration af 30, 000 pr 70 mikroliter, derefter frø 70 mikroliter af celleopløsningen inde i hver enkelt brønd kultur indsætte. Tilsæt en milliliter neuronal medium til neuron parabol til at fylde området omkring indsætte og forhindre belægningen fra tørring.På samme måde tilsættes en milliliter endotelcellemedium til den periventrikulære endotelcelleskål. Kontroller cellerne under et mikroskop for at kontrollere, at de ikke lækker fra indsatsrummet, og inkuber dem derefter ved 37 grader celsius og 5 % kuldioxid i 24 timer. Efter inkubationen kontrolleres cellerne igen under mikroskopet for at kontrollere, at de er korrekt fastgjort.48 timer efter såning fjernes indsatsen forsigtigt med steril pincet, og cellerne under mikroskopet kontrolleres, at cellelaget forbliver uforstyrret. Fjern mediet fra både neuron og periventrikulære endotelcelleretter, og tilsæt en milliliter frisk medium til hver skål. Inkuber cellerne ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid i fem dage.Fjern derefter mediet, fastgør cellerne med 4% PFA i 10 minutter og vask dem tre gange med PBS. For at udføre co-kultur assay, suspendere 30, 000 GABAergic interneurons og 30, 000 menneskelige periventrikulære endotelceller i 70 mikroliters af co-kultur medium, derefter frø denne celle løsning inde i en en brønd indsætte rum. Efter 48 timer skal du fjerne indsatsen.Inkuber samkulturen ved 37 grader celsius og 5% kuldioxid i fem dage. Efter inkubationen fjernes mediet, cellerne fastgøres med 4%PFA, og de vaskes tre gange med PBS. For at udføre kemo-attraktion assay, placere en tre godt kultur indsætte i midten af en poly-L-ornit og laminin-belagt 35 millimeter skål, vende skålen på hovedet, og markere grænsen omkring den midterste rum af indsatsen ved hjælp af en permanent markør med en ultra fin spids.Seed 30, 000 GABAergic interneurons i 70 mikroliter af neuronal medium i midten rum, derefter frø 10, 000 periventrikulære endotelceller og 10, 000 kontrol endotelceller og 70 mikroliter af deres respektive medium i de to ydre rum. Tilsæt en milliliter co-kultur medium langs siden af skålen for at forhindre belægningen på fadet fra tørring. Efter 48 timer fjernes indsatsen og inkuberes cellerne ved 37 grader celsius og 5 % kuldioxid i 36 timer.Efter inkubationen fjernes mediet, cellerne fastgøres, og de vaskes tre gange med PBS. Langdistance og co-kultur migration analyser blev brugt til at undersøge samspillet mellem periventrikulære endotelceller og GABAergic neuroner. I den lange distance migration assay, celler startede ud som en rektangulær patch på dag nul, men ved 48 timer, havde de migreret ud i celle-fri plads.Immunokytokemisk farvning med antiaktivt caspase-3 antistof, en markør for apoptose, viste ingen apoptotisk signal i de seedede neuroner. I co-kultur migration assay, når interneurons var co-seedet med menneskelige periventrikulære endotelceller, neuroner rejste længere afstande i forhold til når interneurons var seedet alene, eller når co-seedet med kontrol endotelceller. I kemo-attraktion assay, et betydeligt højere antal interneurons migreret mod periventrikulære endotelceller i forhold til kontrol endotelceller, bekræfter, at GABAergic interneurons reagere selektivt på kemo-attraktive signaler udskilles af periventrikulære endotelceller.Disse analyser kan ændres ved hjælp af ligands, hæmmere eller analyse arenes at få mekanistisk indsigt i samspillet mellem menneskelige periventrikulære endotelceller med menneskelige interneuroner. De kan også bruges til at studere samspillet mellem menneskelige periventrikulære endotelceller med andre neurale celler som rapporteret af vores gruppe og andre. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at fastgøre indsatsen fast på skålen og holde det uforstyrret i hele analysen, ellers kan det føre til cellelækage, celleafskivering eller forskydning af indsatsen med den tegnede grænse.Vores arbejde har vist celle autonome rolle menneskelige periventrikulære endotelceller i patogenesen af psykiatriske lidelser som skizofreni, epilepsi og autisme. Disse analyser vil derfor gøre det muligt at vurdere syge periventrikulære endotelceller fra patienter med disse lidelser ved hjælp af IPSC-teknologien.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat Kortikal neuroner og glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitorisk synapsedannelse i en Co-kultur model, som indeholder GABAerge Medium Langustre neuroner og HEK293-celler stabilt udtrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrodsganglier neuroner og differentierede adipøst afledte stamceller: An<em&gt; In vitro</em&gt; Co-kultur Model til Uddannelse Perifere nerveregenerering

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Tælling af neurale stamceller Brug Klonale Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høj hastighed Stretch skade af menneskelig induceret pluripotente stamceller-afledt neuroner i en 96-brønds Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Opdeling af humane stamcelle-afledte neuroner inden for præ-monterede plastik Microfluidic chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...