Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des prix de l'Institut national de la santé mentale (R01MH110438) et national institut des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01NS100808) à AV.

1. Culture et stockage des cellules endothéliales periventriculaires humaines
<ol><li>Maintenir les cellules endothéliales periventriculaires humaines sur la matrice de membrane du sous-sol (voir Tableau des matériaux)plaques de 6 puits dans le milieu cellulaire endothélial periventriculaire (milieu E6 contenant 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 et 5 M GABA) à 37 oC et 5 % CO2. Changer de moyen tous les jours alternatifs.</li>
	<li>Décongeler la matrice de membrane du sous-sol en 4 oC et...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

Ici, nous avons décrit trois essais in vitro qui fournissent ensemble l'évaluation quantitative des propriétés endothéliales endothéliales humaines de cellules-spécifiques. Ces essais seront utiles pour obtenir des connaissances mécanistes sur l'interaction des cellules endothéliales periventriculaires humaines avec les interneurones humains. Des expériences utilisant des ligands, des inhibiteurs ou des cellules présentant un renversement ou une surexpression spécifique au gène identifieront ou valideront de...

Les cellules endothéliales forment la muqueuse des vaisseaux sanguins et les fonctions importantes de médiation qui incluent le maintien de la perméabilité de mur de vaisseau, la régulation du flux sanguin, l'agrégation de plaquette, et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Dans le cerveau, les cellules endothéliales font partie d'une barrière hémato-encéphalique critique qui contrôle étroitement l'échange de matériaux entre le cerveau et la circulation sanguine1. Nos études dans la dernière décennie ont identifié de nouveaux rôles neurogènes des cellules endothéliales de cerveau qui ont des implications significatives pour le développement et le comportement de cerveau2,3,4,5. Nous avons montré que le cerveau embryonnaire de souris est vascularisé par deux sous-types distincts des navires, les vaisseaux pial et les vaisseaux périventriculaires, qui diffèrent dans l'anatomie, l'origine, et le profil développemental2. Les cellules endothéliales qui tapissent ces deux sous-types de vaisseaux présentent des différences distinctes dans leurs profils d'expression génique. Tandis que les cellules endothéliales piales expriment principalement des gènes liés à l'inflammation et à la réponse immunitaire, les cellules endothéliales periventriculaires sont uniquement enrichies dans l'expression des gènes généralement associés à la neurogenèse, à la migration neuronale, à la chimiotaxie, et au guidage d'axone3. Les cellules endothéliales periventriculaires abritent également une nouvelle voie de signalisation DE GABA qui est distincte de la voie neuronale traditionnelle de signalisation de GABA5. En même temps que son expression génique, des cellules endothéliales periventriculaires ont été trouvées pour réguler la migration et la distribution des interneurons GABAergic dans le néocortex en développement. Pendant le développement embryonnaire, les cellules endothéliales periventriculaires subissent la migration à longue distance le long d'un gradient ventral-dorsal pour établir le réseau vasculaire periventriculaire2,3. Cette route migratoire est reflétée un jour plus tard par des interneurones. Les interneurones migrateurs interagissent physiquement avec le réseau vasculaire périventriculaire préformé et l'utilisent comme guide pour atteindre leur destination finale dans le néocortex. En plus d'agir comme substrat physique, les cellules endothéliales périventriculaires servent de source de repères de navigation pour les neurones migrateurs. Periventricular endothelial cell-secreted GABA guide la migration interneuron et régule leurs modèles de distribution finale4. Les défauts dans la migration et la distribution interneuron sont associés aux désordres neuropsychiatriques tels que l'autisme, l'épilepsie, la schizophrénie et la dépression6,7,8,9,10. Par conséquent, l'étude des fonctions endothéliales periventriculaires de cellules et de leur influence sur la migration interneuron dans le contexte humain devient critique pour adresser la pathogénie de ces désordres.
Nous avons généré des cellules endothéliales periventriculaires humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines dans notre laboratoire11, en utilisant la technologie induite des cellules souches pluripotentes (iPSC)12,13. Pour valider si les cellules endothéliales periventriculaires humaines imitent fidèlement les cellules endothéliales periventriculaires de souris, et pour évaluer quantitativement leur influence sur la migration interneuron, nous avons développé trois essais in vitro : un essai de migration à longue distance, un essai de migration de co-culture, et un essai de chimio-attraction. Ici, nous décrivons les protocoles pour ces essais en détail. Les trois essais sont basés sur l'utilisation d'inserts de culture de silicone pour créer un petit patch rectangulaire de cellules (de dimensions fixes) entouré s'un de l'espace sans cellules. La distance de migration est évaluée en mesurant la distance entre les positions finales des cellules à partir de la bordure de la plaque rectangulaire qui a été décrite le jour 0. Dans l'essai de migration à longue distance, les cellules endothéliales periventriculaires humaines sont enseventées comme un patch au centre d'un plat de 35 mm, et les distances parcourues par les cellules sur une longue période de temps sont calculées. Dans l'essai de migration de co-culture, les cellules endothéliales periventriculaires humaines sont co-enseçantes avec des interneurons humains comme un patch dans un plat de 35 mm. Cette configuration permet d'examiner l'effet des interactions physiques directes de ces deux types de cellules sur le taux de migration des interneurones. L'exemple de chimio-attraction mesure la migration des interneurones en réponse aux indices chimio-attrayants sécrétés par les cellules endothéliales periventriculaires humaines. Les interneurones sont ensedus comme un patch rectangulaire, avec des cellules endothéliales periventriculaires humaines et contrôlent les cellules endothéliales non periventriculaires ensevulées comme des taches de taille similaire de chaque côté. Chacune des plaques cellulaires est séparée par un espace sans cellules de 500 m. La réponse des interneurones est évaluée en quantifiant le nombre de cellules qui ont migré vers les cellules endothéliales periventriculaires par rapport au contrôle des cellules endothéliales non perventriculaires.
Ces essais fournissent l'évaluation robuste des fonctions endothéliales periventriculaires humaines de cellules et de leur influence sur la migration interneuron. La nouvelle configuration de l'analyse longue distance et de l'analyse de la migration par co-culture fournit un espace libre de cellules dans la gamme de centimètres (1-1,5 cm) pour permettre la détection de la migration à longue distance. Un résumé des caractéristiques de nos essais par rapport à d'autres essais populaires est présenté dans le tableau 1. Collectivement, les essais décrits ici serviront de plate-forme pour évaluer les cellules endothéliales periventriculaires « malades » et les interneurons générés par les iPSC des désordres de cerveau comme la schizophrénie, l'autisme ou l'épilepsie. Ces essais peuvent également être utilisés pour déterminer comment différentes conditions (p. ex. inhibiteurs, ligands, ARNi) affectent la migration cellulaire. Enfin, ces tests peuvent être optimisés pour d'autres types de cellules afin de mesurer la migration à longue distance, la chimio-attraction ou la migration par mediated cellule-cell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

Le rôle de la vascularisation du cerveau dans le développement du système nerveux et l'étiologie des troubles cérébraux attire de plus en plus l'attention. Nos études récentes ont identifié une population spéciale de cellules vasculaires, les cellules endothéliales periventriculaires, qui jouent un rôle critique dans la migration et la distribution des interneurones GABAergic avant-cerveau pendant le développement embryonnaire. Ceci, couplé avec leurs fonctions cellulaires-autonomes, fait allusion à de nouveaux rôles des cellules endothéliales periventriculaires dans la pathologie des désordres neuropsychiatriques comme la schizophrénie, l'épilepsie, et l'autisme. Ici, nous avons décrit trois essais in vitro différents qui évaluent collectivement les fonctions des cellules endothéliales periventriculaires et leur interaction avec les interneurons GABAergic. L'utilisation de ces tests, en particulier dans un contexte humain, nous permettra d'identifier le lien entre les cellules endothéliales periventriculaires et les troubles cérébraux. Ces essais sont simples, peu coûteux et reproductibles, et peuvent être facilement adaptés à n'importe quel type de cellule adhérente.

Les étapes pour mettre en place un insert de culture d'un puits à l'intérieur d'un plat de 35 mm sont indiquées dans la figure 1. L'assay de migration à longue distance et l'assay de migration de co-culture ont utilisé un insert d'un puits pour ensemencer le nombre désiré de cellules au centre d'un plat de 35 mm enduit de poly-L-ornithine/laminin. Le jour 0, les cellules étaient présentes sous forme de patch rectangulaire(figure...

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Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Nous présentons trois essais in vitro simples -l'analyse de migration à longue distance, l'analyse de migration de co-culture, et l'analyse de chimio-attraction--qui évaluent collectivement les fonctions des cellules souches humaines dérivées des cellules périventriculaires endothéliales et de leur interaction avec les interneurons GABAergic.

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Ce protocole décrit trois analyses in vitro qui évaluent collectivement les fonctions des cellules endothéliales périventriculaires humaines et leur interaction avec les interneurones GABAergic humains. Les résultats de ces analyses fourniront un aperçu critique du lien entre les cellules endothéliales périventriculaires et les troubles cérébraux. Ces analyses sont simples, peu coûteux et permettent de mesurer la migration cellulaire de l’aire de répartition des centimètres, ce qui n’est pas réalisé par d’autres analyses existantes.Les défauts de migration et de distribution des interneurones gabaergiques sont associés à des troubles psychiatriques, tels que l’autisme, l’épilepsie, la schizophrénie et la dépression. Par conséquent, il est essentiel d’étudier l’interaction des cellules endothéliales périventriculaires avec les interneurones GABAergic dans le contexte humain pour adresser la pathogénie de ces désordres. Commencez par préparer les cellules humaines pour l’analyse.Permettre aux cellules endothéliales périventriculaires humaines d’atteindre 70 à 80% de confluence puis de les dissocier selon les directives du manuscrit et de les compter à l’aide de la méthode d’exclusion bleue trypan. Pour préparer les interneurones GABAergiques humains, la solution de dissociation cellulaire chaude et un aliquot de milieu neuronal à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le milieu de chaque puits contenant des cellules et lavez-les avec un millimètre de PBS par puits.Détachez les cellules en ajoutant 0,5 millilitres de solution de dissociation préchaurée par puits et en les incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajouter un millilitre de milieu neuronal par puits et transférer la solution cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres, triturant doucement pour dissocier les touffes cellulaires. Centrifuger les cellules à 380 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, aspirer le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire en un millilitre de milieu neuronal.Comptez ensuite les cellules vivantes à l’aide de l’exclusion bleue trypan. Préparer le contrôle des cellules endothéliales humaines en réchauffant la solution de dissociation cellulaire et un aliquot de milieu endothélial à 37 degrés Celsius, 10 minutes avant utilisation. Aspirer le milieu de chaque puits et les laver avec un millilitre de PBS par puits.Détachez les cellules en ajoutant 0,5 millilitres de la solution de dissociation préchauffée à chaque puits et en incubant la plaque à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu cellulaire endothélial par puits pour neutraliser la solution de dissociation et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes, aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en un millilitre de milieu cellulaire endothélial.Ensuite, utilisez la méthode d’exclusion trypan pour compter les cellules. Préparez un insert de culture de puits en coupant trois côtés d’un puits d’un insert de culture de deux puits de silicone avec une lame stérile. Retirez l’insert avec des pinces stériles et placez-le au centre d’un plat en poly-L-ornithine et enrobé de laminine, puis pressez le long du bord de l’insert pour le fixer à la surface.Retournez soigneusement le plat à l’envers pour vérifier que l’insert est fermement adhéré, et marquez la limite du compartiment d’insertion à l’aide d’un marché noir permanent avec une pointe ultra fine. Suspendre les interneurones GABAergiques humains dans les cellules endothéliales périventriculaires moyennes et humaines neuronales et les cellules endothéliales moyennes à une concentration de 30 000 pour 70 microlitres, puis ensemencer 70 microlitres de la solution cellulaire à l’intérieur de chaque insert de culture de puits. Ajouter un millilitre de milieu neuronal au plat de neurones pour remplir la zone autour de l’insert et empêcher le revêtement de sécher.De même, ajouter un millilitre de milieu cellulaire endothélial au plat périventriculaire des cellules endothéliales. Vérifiez les cellules au microscope pour vérifier qu’elles ne fuient pas du compartiment d’insertion, puis incubez-les à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après l’incubation, vérifiez à nouveau les cellules au microscope pour vérifier qu’elles sont bien attachées.48 heures après l’ensemencement, retirer délicatement l’insert à l’aide d’une pince stérile et vérifier les cellules au microscope pour vérifier que la couche cellulaire reste intacte. Retirez le milieu du neurone et des plats périventriculaires des cellules endothéliales, et ajoutez un millilitre de milieu frais à chaque plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours.Ensuite, retirez le milieu, fixez les cellules avec 4%PFA pendant 10 minutes et lavez-les trois fois avec PBS. Pour effectuer l’analyse de co-culture, suspendre 30 000 interneurones gabaergiques et 30 000 cellules endothéliales périventriculaires humaines dans 70 microlitres de milieu de co-culture, puis ensemencer cette solution cellulaire à l’intérieur d’un compartiment d’insertion d’un puits. Après 48 heures, retirer l’insert.Incuber la co-culture à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Après l’incubation, retirer le milieu, fixer les cellules avec 4%PFA et les laver trois fois avec PBS. Pour effectuer l’analyse de chimio-attraction, placez un insert de culture de trois puits au centre d’un plat poly-L-ornithine et laminin-enduit de 35 millimètres, tournez le plat à l’envers, et marquez la frontière autour du compartiment central de l’insert à l’aide d’un marqueur permanent avec une pointe ultra fine.Graine 30 000 interurons GABAergic dans 70 microlitres de milieu neuronal dans le compartiment central, puis graine 10 000 cellules endothéliales périventriculaires et 10 000 cellules endothéliales de contrôle et 70 microlitres de leur milieu respectif dans les deux compartiments extérieurs. Ajouter un millilitre de milieu de co-culture le long du côté du plat pour empêcher le revêtement sur le plat de sécher. Après 48 heures, retirer l’insert et incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 36 heures.Après l’incubation, retirer le milieu, fixer les cellules et les laver trois fois avec PBS. Des analyses de migration à longue distance et de co-culture ont été utilisées pour étudier les interactions entre les cellules endothéliales périventriculaires et les neurones GABAergic. Dans l’analyse de migration à longue distance, les cellules ont commencé comme un patch rectangulaire le jour zéro, mais par 48 heures, ils avaient migré dans l’espace sans cellules.La coloration immunocytochimique avec l’anticorps anti-actif Caspase-3, un marqueur de l’apoptose, n’a montré aucun signal apoptotique dans les neurones ensemencés. Dans l’analyse de la migration de co-culture, lorsque les interneurones étaient co-ensemencés avec des cellules endothéliales périventriculaires humaines, les neurones parcouraient des distances plus éloignées que lorsque les interurônes étaient ensemencés seuls ou lorsqu’ils étaient cosemencés avec des cellules endothéliales de contrôle. Dans l’analyse de chimio-attraction, un nombre sensiblement plus élevé d’interneurones ont migré vers les cellules endothéliales périventriculaires comparées aux cellules endothéliales de contrôle, confirmant que les interneurones GABAergic répondent sélectivement aux indices chemo-attrayants sécrétés par les cellules endothéliales périventriculaires.Ces analyses peuvent être modifiées à l’aide de ligands, inhibiteurs ou arenes d’essai pour obtenir des aperçus mécanistes sur les interactions des cellules endothéliales périventriculaires humaines avec les interneurones humains. Ils peuvent également être employés pour étudier l’interaction des cellules endothéliales périventriculaires humaines avec d’autres cellules neurales comme rapporté par notre groupe et d’autres. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de fixer fermement l’insert sur le plat et de le garder intact tout au long de l’analyse, sinon il peut conduire à une fuite cellulaire, le détachement cellulaire ou le désalignement de l’insert avec la limite tracée.Nos travaux ont indiqué le rôle autonome cellulaire des cellules endothéliales périventriculaires humaines dans la pathogénie des désordres psychiatriques comme la schizophrénie, l’épilepsie et l’autisme. Ces analyses permettront donc d’évaluer les cellules endothéliales périventriculaires malades dérivées de patients atteints de ces troubles à l’aide de la technologie IPSC.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

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This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Recherche

Neurosciences

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