Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R01MH110438)와 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (R01NS100808)에서 AV에 대한 상을 지원했습니다.

1. 인간 심구 내피 내피 세포의 배양 및 저장
<ol><li>지하 막 매트릭스 코팅에 인간 상피 내피 세포를 유지 (재료의 표참조) 아구실 내피 세포 배지에서 6 웰 플레이트 (E6 배지 를 포함하는 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 및 5 μM GABA) 37 °C 및 5%CO2. 매일 번갈아 매체를 변경합니다.</li>
	<li>4°C에서 지하 멤브레인 매트릭스를 해동하고, 차가운 DMEM/F12 배지에서 희석하여 1:100 용액을 만든다...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

여기서, 우리는 함께 인간 심실 내피 세포 특이적 특성의 정량적 평가를 제공하는 3개의 시험관내 분석시험을 기술했다. 이 해약은 인간 interneurons와 인간 적인 심실 내피 세포의 상호 작용에 기계론적인 통찰력을 얻기에 귀중할 것입니다. 리간드, 억제제 또는 유전자 특이적 녹다운 또는 과발현을 가진 세포를 이용한 실험은 내피 세포 유도 된 세포 유도 인터뉴런 이동 또는 심실 내피 세포의 장거...

내피 세포는 혈관의 안대기를 형성하고 혈관 벽 투과성의 유지 보수, 혈류 조절, 혈소판 응집 및 새로운 혈관형성을 포함하는 중요한 기능을 중재합니다. 뇌에서, 내피 세포는 단단히 뇌와 혈류 량 사이의 물질의 교환을 제어하는 중요한 혈액 - 뇌 장벽의 일부를 형성1. 지난 10 년간 우리의 연구는 두뇌 발달및행동2,3,4,5를위한 중요한 연루가 있는 두뇌 내피 세포의 새로운 신경성 역할을 확인했습니다 . 우리는 마우스 배아 전뇌가 해부학, 기원 및 발달 프로필2에서다른 혈관, pial 혈관 및 심실 혈관의 두 가지 별개의 특수형에 의해 혈관화되는 것으로 나타났습니다. 이 2개의 혈관 특수형을 일렬로 세우는 내피 세포는 그들의 유전자 발현 단면도에 있는 명백한 다름을 보여줍니다. 피알 내피 세포는 주로 염증 및 면역 반응과 관련된 유전자를 발현하는 반면, 내피 세포는 신경 발생, 신경 이동, 화학변증 및 축세포유도와일반적으로 연관된 유전자의 발현에서 유일하게 풍부하다. 심실 내피 세포는 또한 전통적인 신경 GABA 신호 통로에서 구별되는 새로운 GABA 신호 통로를 수용5. 그것의 유전자 발현과 수반, 상외 내피 세포는 개발 신피질에서 GABAergic 인터뉴런의 이동 및 분포를 조절하는 것으로 나타났다. 배아 발달 동안, 심실 내피 세포는 심실 혈관 네트워크2,3을확립하기 위해 복부 등쪽 구배를 따라 장거리 이동을 겪는다. 이 철새 경로는 하루 후 인터뉴런에 의해 미러됩니다. 인터뉴런을 이동하는 것은 미리 형성된 심실 혈관 네트워크와 물리적으로 상호 작용하고 신피질에서 최종 목적지에 도달하기 위한 가이드레일로 사용합니다. 물리적 기질로 작용하는 것 이외에, 상피내피 세포는 뉴런을 이동하기위한 탐색 단서의 소스 역할을합니다. 상피 내피 세포 분비 GABA는 인터 뉴런 마이그레이션을 안내하고 최종 분포 패턴을 조절4. 인터뉴런 이동 및 분포의 결함은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 우울증6,7,8,9,10과같은 신경 정신 장애와 관련이 있습니다. 따라서, 상복부 내피 세포 기능의 연구와 인간의 맥락에서 인터 뉴런 이동에 미치는 영향은 이러한 장애의 발병 기전을 해결하기위한 중요하게된다.
우리 실험실11에서인간 배아 줄기세포로부터 인간 심상외형 내피세포를 생성하였을 때, 유도된 만능 줄기세포(iPSC) 기술12,13을이용하여 생성하였다. 인간 심상외 외 피실 내피 세포가 마우스 심구 내피 세포를 충실하게 모방하는지 확인하고, 간 신경 세포 이동에 미치는 영향을 정량적으로 평가하기 위해, 우리는 세 가지 시험관 내 분석분석( 장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석 및 화학 적 매력 분석)을 개발했습니다. 여기에서 우리는 이 분석에 대한 프로토콜을 자세히 기술합니다. 세 가지 모든 측정법은 실리콘 배양 인서트의 사용을 기반으로 세포가 없는 공간으로 둘러싸인 작은 직사각형 세포 패치(고정 치수)를 생성합니다. 마이그레이션 거리는 0일째에 설명된 직사각형 패치의 테두리로부터 셀의 최종 위치 사이의 거리를 측정하여 평가됩니다. 장거리 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시의 중심에 패치로 시드되고, 오랜 시간 동안 세포에 의해 이동된 거리가 계산된다. 공동 배양 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시에 하나의 패치로 인간 인터뉴런과 공동 시드된다. 이 설치는 interneurons의 이동의 비율에 이 두 세포 모형의 직접적인 물리적 상호 작용의 효력의 시험을 허용합니다. 화학 적 매력 분석 인간 심구 내피 세포에 의해 분비 된 화학 매력적인 단서에 대한 응답으로 인터 뉴런의 이동을 측정합니다. 인터뉴런은 직사각형 패치로 시드되고, 인간 심상 외 내피 세포와 함께 양쪽에 비슷한 크기의 패치로 시드된 비-심실 내피 세포를 제어합니다. 각 세포 패치는 500 μm의 세포 없는 간격에 의해 분리됩니다. interneurons의 반응은 비-periventricular 내피 세포를 대조하기 위하여 비교된 심실 내피 세포로 이동한 세포의 수를 정량화해서 평가됩니다.
이 해약은 인간 periiicular 내피 세포 기능및 interneuron 이동에 대한 그들의 영향의 강력한 평가를 제공합니다. 새로운 장거리 분석 및 공동 배양 이동 분석법은 센티미터(~1-1.5cm) 범위의 무세포 공간을 제공하여 장거리 이동을 감지할 수 있도록 합니다. 다른 인기 있는 어세이에 비해 당사의 검사의 특징에 대한 요약은 표 1에제시되어 있다. 집합적으로, 여기에서 기술된 계산은 정신 분열증, 자폐증 또는 간질 같이 두뇌 무질서의 iPSCs에서 생성된 "병든" 내피 내피 세포 및 interneurons를 평가하기 위한 발판으로 봉사할 것입니다. 이 계산은 또한 어떻게 다른 조건 (예를 들면 억제제, 리간드, RNAi)가 세포 이동에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 측정은 장거리 이동, 화학 적 인매력 또는 세포 매개 이동을 측정하기 위하여 그밖 세포 모형을 위해 최적화될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

신경계 발달과 뇌 질환의 병인학에서 뇌 혈관의 역할은 점점 더 주목받고 있습니다. 우리의 최근 연구는 혈관 세포의 특별한 인구를 확인했다, 심실 내피 세포, 그 배아 발달 동안 전뇌 GABAergic 인터뉴런의 마이그레이션 및 분포에 중요한 역할을. 이것은, 그들의 세포 자율 기능과 더불어, 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 신경 정신병학 무질서의 병리에 있는 심실 내피 세포의 새로운 역할을 암시합니다. 여기에서, 우리는 집합적으로 상피실 내피 세포의 기능 및 GABAergic interneurons와의 그들의 상호 작용을 평가하는 3개의 다른 시험관내 검문학을 기술했습니다. 이러한 검소의 사용, 특히 인간의 맥락에서, 우리는 심실 내피 세포와 뇌 질환 사이의 링크를 식별 할 수 있습니다. 이 어설션은 간단하고, 저렴하며, 재현 가능하며, 모든 부착 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있습니다.

35mm 접시 내부에 원웰 배양 인서트를 설정하는 단계는 도 1에나와 있다. 장거리 이동 분석 및 공동 배양 이동 분석은 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 된 35 mm 접시의 중심에 원하는 수의 세포를 시드하기 위해 원웰 인서트를 사용했다. 0일째에, 세포는 직사각형 패치로서존재하였다(도 2A,C). 0일 차 이미지에서는 셀 레이...

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Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

이 프로토콜은 인간 심실 내피 세포의 기능과 인간 GABAergic interneurons와의 상호 작용을 종합적으로 평가하는 3개의 체외 분석서를 설명합니다. 이 assays에서 결과는 심실 내피 세포와 두뇌 무질서 사이 링크에 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 이러한 저법은 간단하고 저렴한 비용으로 다른 기존 에세이에 의해 달성되지 않는 센티미터 범위에서 세포 이동을 측정할 수 있습니다.GABAergic interneurons의 이주 및 분포에 있는 결점은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 불경기와 같은 정신 장애와 연관됩니다. 따라서, 이러한 장애의 발병을 해결하기 위해 인간의 맥락에서 GABAergic interneurons와 periventriricular 내피 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 분석에 대한 인간 세포를 준비하여 시작합니다.인간 대기실 내피 세포가 70~80%의 합류에 도달한 다음 원고의 지시에 따라 해리하여 trypan blue 배제 방법을 사용하여 계산하도록 허용합니다. 인간 GABAergic 인터뉴런을 준비하려면, 따뜻한 세포 해리 액스와 10 분 동안 섭씨 37도에서 신경 매체의 알리쿼트. 그런 다음 세포를 포함하는 각 우물에서 배지를 흡인하고 잘 당 PBS의 1 밀리미터로 씻어.우물당 0.5 밀리리터의 예온 된 해리 용액을 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 세포를 분리하십시오. 인큐베이션 후, 잘 당 신경 매체의 1 밀리리터를 추가하고 15 밀리리터 원추형 튜브로 세포 용액을 전송, 부드럽게 세포 덩어리를 해리. 실온에서 5분 동안 380배 G의 세포를 원심분리하고, 슈퍼나탄을 흡인시키고, 뉴런 배지의 1밀리리터에서 세포 펠릿을 재연한다.그런 다음 trypan 파란색 제외를 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. 세포 해리 용액과 내피 배지의 알리쿼트(aliquot)를 사용하기 10분 전섭씨 37도에서 따뜻하게 하여 인체 내피 세포를 조절할 수 있다. 각 우물에서 배지를 흡인하고 잘 당 PBS의 1 밀리리터로 씻어.각 우물에 예온 된 해리 용액의 0.5 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하여 세포를 분리하십시오. 이어서, 내피 세포 배지의 1밀리리터를 잘 첨가하여 해리 용액을 중화시키고 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 이송한다. 세포를 5분 동안 200배 G로 원심분리하고, 수퍼나티를 흡인시키고 내피 세포 배지의 1밀리리터로 세포를 재연한다.그런 다음 trypan 제외 방법을 사용하여 셀을 계산합니다. 멸균 블레이드를 가진 2개의 잘 실리콘 배양 인서트의 1개의 웰의 3개의 쪽을 절단하여 하나의 웰 배양 인서트를 준비합니다. 멸균 핀셋으로 인서트를 제거하고 폴리 L-ornithine 및 라미닌 코팅 접시의 중앙에 배치한 다음 인서트의 가장자리를 따라 눌러 표면에 고정합니다.접시를 거꾸로 뒤집어 인서트가 단단히 부착되었는지 확인하고, 초미세 팁이 있는 영구 암시장을 사용하여 인서트 구획의 경계를 표시합니다. 70 마이크로리터 당 30, 000의 농도에서 신경 배지 및 인간 심실 내피 세포 및 내피 세포 배지에서 인간 GABAergic interneurons를 중단한 다음 각 음배양 삽입 내부의 세포 용액의 70 마이크로리터를 시드한다. 뉴런 배지 1밀리리터를 뉴런 접시에 추가하여 삽입 주변 영역을 채우고 코팅이 건조되는 것을 방지합니다.마찬가지로, 심실 내피 세포 접시에 내피 세포 배지 의 1 밀리리터를 추가합니다. 현미경의 밑에 세포를 확인하여 삽입 구획에서 누출되지 않는지 확인한 다음 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 잠복 후 현미경으로 세포를 다시 확인하여 제대로 부착되었는지 확인하십시오.파종 후 48시간 후, 멸균 핀셋으로 인서트를 부드럽게 제거하고 현미경으로 세포를 확인하여 세포층이 방해받지 않고 남아 있는지 확인합니다. 뉴런과 심실 내피 세포 접시모두에서 배지를 제거하고 각 접시에 신선한 배지 1 밀리리터를 추가합니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 5일간 배양합니다.그런 다음, 매체를 제거하고, 세포를 4%PFA로 10분 동안 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 공동 배양 분석법을 수행하기 위해, 30, 000 GABAergic 인터뉴런 및 30, 000 인간의 periventriricular 내피 세포70 마이크로리터의 공동 배양 배지를 중단한 다음 이 세포 용액을 하나의 잘 삽입 구획 내부에 시드한다. 48시간 후에 인서트를 제거합니다.5일 동안 공동 배양을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 4%의 PFA로 세포를 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 화학 어트랙션 분석작업을 수행하려면 폴리 L-ornithine 및 라미닌 코팅 35mm 접시의 중앙에 3개의 웰 배양 인서트를 배치하고, 접시를 거꾸로 뒤집어 초미세 팁이 있는 영구 마커를 사용하여 인서트의 중간 구획 주위에 경계를 표시합니다.종자 30, 000 GABAergic interneurons 70 중간 구획에 있는 뉴런 배지의 마이크로 리터, 다음 씨앗 10, 000 periventriricular 내피 세포 와 10, 000 제어 내피 세포와 70 두 개의 외부 구획에 그들의 각각의 매체의 마이크로 리터. 접시 의 측면을 따라 공동 배양 매체의 1 밀리리터를 추가하여 접시의 코팅이 건조되는 것을 방지합니다. 48시간 후, 인서트를 제거하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 36시간 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 매체를 제거하고 세포를 수정하고 PBS로 세 번 세척합니다. 장거리 및 공동 배양 이동 소는 심실 내피 세포와 GABAergic 뉴런 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. 장거리 마이그레이션 분석에서 세포는 0일째에 직사각형 패치로 시작했지만 48시간으로 셀이 없는 공간으로 마이그레이션했습니다.세포사멸의 마커인 항활성 Caspase-3 항체를 사용하여 면역세포화학 염색은 종자 뉴런에서 세포사멸 신호를 보이지 않았다. 공동 배양 이동 분석에서 인터뉴런이 인간 심실 내피 세포와 공동 시드되었을 때, 뉴런은 인터뉴런이 단독으로 시드되거나 대조 내피 세포와 공동 시드될 때와 비교하여 더 먼 거리를 여행했습니다. 화학-어트랙션 분석에서, 내피 세포를 제어하는 것에 비해 심실 내피 세포를 향해 이동하는 인터뉴런의 수가 상당히 높으며, GABAergic interneurons가 대기실 내피 세포에 의해 분비된 화학 요법 매력적인 단서에 선택적으로 반응한다는 것을 확인합니다.이러한 분석안은 인간 간 신경 세포와 인간의 심실 내피 세포의 상호 작용에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위해 리간드, 억제제 또는 분석 아렌을 사용하여 수정될 수 있습니다. 그(것)들은 또한 우리의 단 및 그 외에 의해 보고된 것과 같이 그밖 신경 세포와 인간 심실 내피 세포의 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 접시에 삽입을 단단히 고정하고 분석 전반에 걸쳐 방해받지 않도록 유지하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 구그린 경계로 삽입물의 세포 누설, 세포 분리 또는 정렬 불량으로 이어질 수 있습니다.우리의 일은 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 정신 장애의 병기에서 인간 심실 내피 세포의 세포 자율적인 역할을 표시했습니다. 이러한 assays는 그러므로 IPSC 기술을 사용하여 이 무질서를 가진 환자에게서 파생된 병든 심실 내피 세포의 평가를 허용할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

연구

신경과학

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현<sub&gt;</sub&gt; 수용체

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...