Name: migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av priser fra National Institute of Mental Health (R01MH110438) og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) til AV.

1. Kultur og lagring av humane periventtrikulære endotelceller
<ol><li>Vedlikehold humant periventtrikulær endotelceller på kjellermembranmatrisebelagt (se Materialtabell) 6-brønnplater i periventtrikulær endotelcellemedium (E6 medium som inneholder 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 og 5 μM GABA) ved 37 °C og 5 % CO2. Bytt medium hver eneste dag.</li>
	<li>Tin kjellermembranmatrisen i 4 °C, og lag en 1:100-løsning ved å fortynne den i kaldt DMEM/F12 medium. Coat hver brønn av en 6-b...

<ol>
	<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier:+From+Physiology+to+Disease+and+Back.">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).</li><li>Won, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nature Communications. 4, 2149 (2013).</li><li>Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+VEGF+sculpts+cortical+cytoarchitecture.">Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-derived+GABA+signaling+modulates+neuronal+migration+and+postnatal+behavior.">Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior.</a> Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).</li><li>Lewis, D. A., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+as+a+disorder+of+neurodevelopment.">Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).</li><li>Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibitory+neurons+and+schizophrenia.">Cortical inhibitory neurons and schizophrenia.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).</li><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders.">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li><li>Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neocortical+interneuron+development+and+the+implications+for+neurodevelopmental+disorders.">Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders.</a> Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).</li><li>Treiman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+mechanisms+in+epilepsy.">GABAergic mechanisms in epilepsy.</a> Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).</li><li>Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+forebrain+endothelial+cells+for+cell-based+therapy+of+neuropsychiatric+disorders.">Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders.</a> Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).</li><li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+the+new+patient?.">Induced pluripotent stem cells: the new patient?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).</li><li>Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modelling+neurodevelopmental+disorders.">Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).</li><li>Vissapragada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+crosstalk+between+periventricular+endothelial+cells+and+neural+progenitor+cells+promotes+the+formation+of+a+neurovascular+unit.">Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit.</a> Brain Research. 1565, 8-17 (2014).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+The+Transwell+Migration+Assay.">Cell Biology. The Transwell Migration Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Renaud, J., Martinovic, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact.">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).</li><li>Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+chemotaxis+using+the+Dunn+direct-viewing+chamber.">Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber.</a> Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).</li><li>Kim, B. J., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+mammalian+cell+chemotaxis.">Microfluidics for mammalian cell chemotaxis.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).</li></ol>

Her beskrev vi tre in vitro-analyser som sammen gir kvantitativ vurdering av humane periventtrikulære endotelcellespesifikke egenskaper. Disse analyser vil være verdifulle i å få mekanistisk innsikt i samspillet mellom menneskelige periventtrikulære endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter ved hjelp av ligander, inhibitorer eller celler med genspesifikk knockdown eller overexpression vil identifisere eller validere molekylære spillere som megler endothelial cellestyrt interneuron migrasjon eller ...

Endotelceller danner foring av blodkar og megle viktige funksjoner som inkluderer vedlikehold av fartøyets veggpermeabilitet, regulering av blodstrøm, blodplateaggregasjon og dannelse av nye blodkar. I hjernen er endotelceller en del av en kritisk blod-hjernebarriere som kontrollerer utveksling av materialer mellom hjernen og blodet1. Våre studier i det siste tiåret har identifisert nye nevrogene roller i hjernen endotelceller som har betydelige implikasjoner for hjernens utvikling og atferd2,3,4,5. Vi har vist at musen embryonale forebrain er vaskalisert av to forskjellige undertyper av fartøy, pial fartøy og periventrikulære fartøy, som varierer i anatomi, opprinnelse, og utviklingsprofil2. Endotelceller som fôrer disse to fartøyundertypene viser tydelige forskjeller i genuttrykksprofilene sine. Mens pial endotelceller for det meste uttrykker gener relatert til betennelse og immunrespons, er periventrikulære endotelceller unikt beriket i uttrykk for gener som vanligvis er forbundet med nevrogenese, nevronal migrasjon, chemotaxis og axon veiledning3. Periventtrikulære endotelceller huser også en ny GABA-signalvei som er forskjellig fra den tradisjonelle nevronale GABA-signalveien5. Samtidig med genuttrykket ble periventrikulære endotelceller funnet å regulere migrasjon og distribusjon av GABAerge interneuroner i den utviklende neocortex. Under embryonisk utvikling gjennomgår periventrikulære endotelceller langdistansemigrasjon langs en ventral-dorsal gradient for å etablere det periventrikulære vaskulære nettverket2,3. Denne trekkruten speiles en dag senere av interneuroner. Migrerende interneuroner samhandler fysisk med det forhåndsdannede periventrikulære vaskulære nettverket og bruker det som et styreskinne for å nå sitt endelige mål i neocortex. I tillegg til å fungere som et fysisk substrat, tjener periventulære endotelceller som kilden til navigasjonssignaler for migrerende nevroner. Periventtrikulær endotelcelleutskilles GABA guider interneuron migrasjon og regulerer deres endelige distribusjonsmønstre4. Defekter i interneuron migrasjon og distribusjon er forbundet med nevropsykiatriske lidelser som autisme, epilepsi, schizofreni og depresjon6,7,8,9,10. Derfor blir studie av periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon i menneskelig sammenheng avgjørende for å håndtere patogenesen av disse lidelsene.
Vi har generert humane periventrikulære-lignende endotelceller fra humane embryonale stamceller i vårt laboratorium11, ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi12,13. For å validere om menneskelige periventrikulære endotelceller trofast etterligner mus periventtrikulær endotelceller, og for å kvantitativt vurdere deres innflytelse på interneuron migrasjon, utviklet vi tre in vitro analyser: en langdistanse migrasjon analyse, en co-kultur migrasjon analyse, og en kjemo-attraksjon analyse. Her beskriver vi protokoller for disse analysene i detalj. Alle tre analysene er basert på bruk av silikonkulturinnsatser for å skape en liten rektangulær cellelapp (av faste dimensjoner) omgitt av cellefri plass. Overføringsavstanden evalueres ved å måle avstanden mellom de endelige plasseringene til cellene fra kanten av det rektangulære plasteret som er skissert på dag 0. I langdistanse migrasjonsanalysen seedes humane periventrikulære endotelceller som en i midten av en 35 mm tallerken, og avstandene som kjøres av cellene over lang tid beregnes. I co-kultur migrasjon analysen, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seeded med menneskelige interneurons som en i en 35 mm tallerken. Dette oppsettet tillater undersøkelse av effekten av direkte fysiske interaksjoner av disse to celletypene på frekvensen av migrering av interneuroner. Den kjemo-attraksjon analysen måler migrasjon av interneurons som svar på kjemo-attraktive signaler utskilt av menneskelige periventtrikulære endotelceller. Interneurons er seeded som en rektangulær patch, med menneskelige periventtrikulære endotelceller og kontroll ikke-periventtrikulær endotelceller sådd som lignende størrelse flekker på hver side. Hver av cellepatchene er adskilt av et cellefritt gap på 500 μm. Respons av interneuroner vurderes ved å kvantifisere antall celler som har migrert mot periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontroll av ikke-periventtrikulære endotelceller.
Disse analyser gir robust vurdering av menneskelige periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon. Det nye oppsettet av langdistanseanalyse og co-kultur migrasjon analyse gir cellefri plass i området centimeter (~ 1-1,5 cm) for å tillate påvisning av langdistanse migrasjon. Et sammendrag av funksjonene i våre analyser sammenlignet med andre populære analyser presenteres i tabell 1. Samlet vil analysene som er beskrevet her tjene som en plattform for å vurdere "syke" periventrikulære endotelceller og interneuroner generert fra iPSCer av hjernesykdommer som schizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analysene kan også brukes til å avgjøre hvordan ulike forhold (f.eks. hemmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrasjon. Til slutt kan disse analysene optimaliseres for andre celletyper for å måle langdistanseoverføring, kjemo-tiltrekning eller cellecellemediert migrering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accutase dissociation solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCR005</td>
			<td>Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human &#946;-Tubulin antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>802001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD31 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CBL468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- MAP2 antibody</td>
			<td>Neuromics</td>
			<td>CH22103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-active Caspase 3 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB3623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control human endothelial cells</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEMF/12 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E6 medium</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>33016-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neurons base medium</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GABAergic neuron Neural supplement</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>M1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>p4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td>Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>Lifeline Cell Technologies</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>Component of control human endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-well silicone culture-Insert</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-832-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axiovert 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

migration, chemo-attraction, and co-culture assays for human stem cell-derived endothelial cells and gabaergic neurons

Rollen til hjernens vaskulatur i nervesystemet utvikling og etiologi av hjernesykdommer blir stadig mer oppmerksomhet. Våre nyere studier har identifisert en spesiell populasjon av vaskulære celler, periventtrikulære endotelceller, som spiller en kritisk rolle i migrering og distribusjon av forebrain GABAergic interneurons under embryonisk utvikling. Dette, kombinert med deres celle-autonome funksjoner, hentydder til nye roller av periventtrikulære endotelceller i patologien til nevropsykiatriske lidelser som schizofreni, epilepsi og autisme. Her har vi beskrevet tre forskjellige in vitro analyser som kollektivt evaluerefunksjonene til periventtrikulære endotelceller og deres interaksjon med GABAergic interneurons. Bruk av disse analysene, spesielt i menneskelig sammenheng, vil tillate oss å identifisere sammenhengen mellom periventtrikulære endotelceller og hjernesykdommer. Disse analysene er enkle, lave kostnader og reproduserbare, og kan enkelt tilpasses enhver tilhengercelletype.

Trinnene for å sette opp en en-brønns kulturinnsats inne i en 35 mm tallerken vises i figur 1. Langdistanse migrasjonsanalyse og co-kultur migrasjon analyse brukt en one-well innsats for å så ønsket antall celler i midten av en poly-L-ornithine / laminin belagt 35 mm parabolen. På dag 0 var cellene til stede som en rektangulær patch (Figur 2A,C). I dag 0 bilder, dagen 0 linjen kan lett identifiseres av den...

Watch this Scientific Journal Video about Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons at JoVE.com

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Vi presenterer tre enkle in vitro analyser-langdistanse migrasjon analyse, co-kultur migrasjon analyse, og kjemo-attraksjon analyse-som kollektivt vurdere funksjonene til menneskelige stamcelle avledet periventtrikulær endotelceller og deres interaksjon med GABAerge interneuroner.

Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Denne protokollen beskriver tre in vitro-analyser som samlet vurderer funksjonene til humane periventrikulære endotelceller og deres interaksjon med humane GABAergic interneurons. Resultater fra disse analysene vil gi kritisk innsikt i sammenhengen mellom periventrikulære endotelceller og hjernesykdommer. Disse analysene er enkle, rimelige og tillater måling av cellemigrasjon i området centimeter, som ikke oppnås ved andre eksisterende analyser.Defekter i migrasjon og distribusjon av GABAergic interneurons er forbundet med psykiatriske lidelser, som autisme, epilepsi, schizofreni og depresjon. Derfor er det viktig å studere samspillet mellom periventrikulære endotelceller med GABAergic interneurons i menneskelig sammenheng for å løse patogenesen av disse lidelsene. Begynn med å forberede menneskelige celler for analysen.La menneskelige periventrikulære endotelceller nå 70 til 80% samløpet og dissosiere dem i henhold til manuskriptets retninger og telle dem ved hjelp av trypan blå eksklusjonsmetoden. For å forberede menneskelige GABAergic interneurons, varm celle dissosiasjon løsning og en aliquot av nevronal medium på 37 grader celsius i 10 minutter. Deretter aspirerer mediet fra hver brønn som inneholder celler og vasker dem med en millimeter PBS per brønn.Løsne cellene ved å legge til 0,5 milliliter med forkriget dissosiasjonsløsning per brønn og inkubere dem ved 37 grader celsius i fem minutter. Etter inkubasjonen legger du til en milliliter nevronal medium per brønn og overfører celleløsningen til et konisk rør på 15 milliliter, og trer forsiktig for å dissosiere celleklumper. Sentrifuger cellene ved 380 ganger G i fem minutter ved romtemperatur, aspirerer det overnaturante og gjenoppusser cellepelleten i en milliliter nevronal medium.Tell deretter de levende cellene ved hjelp av trypan blå ekskludering. Forbered kontroll av humane endotelceller ved å varme opp celledissosiasjonsløsningen og en aliquot av endotelmedium ved 37 grader celsius, 10 minutter før bruk. Aspirer medium fra hver brønn og vask dem med en milliliter PBS per brønn.Løsne cellene ved å tilsette 0,5 milliliter av den forvarmede dissosiasjonsløsningen til hver brønn og inkubere platen ved romtemperatur i fem minutter. Deretter legger du til en milliliter endotelcellemedium per brønn for å nøytralisere dissosiasjonsløsningen, og overføre cellene til et konisk rør på 15 milliliter. Sentrifuger cellene ved 200 ganger G i fem minutter, aspirer de overnaturante og gjenoppusser cellene i en milliliter endotelcellemedium.Bruk deretter trypan-ekskluderingsmetoden til å telle cellene. Forbered en brønnkulturinnsats ved å kutte tre sider av en brønn av en to brønn silikon kultur innsats med et sterilt blad. Fjern innsatsen med sterile pinsett og legg den i midten av en poly-L-ornitin og lamininbelagt tallerken, og trykk deretter langs kanten av innsatsen for å feste den til overflaten.Snu forsiktig fatet opp ned for å kontrollere at innsatsen er godt festet, og merk grensen til innsatsrommet ved hjelp av et permanent svart marked med en ultra fin spiss. Suspender menneskelige GABAergic interneurons i nevronale medium og menneskelige periventrikulære endotelceller og endotelcellemedium i en konsentrasjon på 30.000 per 70 mikroliter, og frø deretter 70 mikroliter av celleløsningen inne i hver brønnkulturinnsats. Tilsett en milliliter nevronal medium til nevronretten for å fylle området rundt innsatsen og forhindre at belegget tørker.På samme måte legger du til en milliliter endotelcellemedium til periventrikulær endotelcellerett. Kontroller cellene under et mikroskop for å kontrollere at de ikke lekker fra innsatsrommet, og inkuber dem deretter ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid i 24 timer. Etter inkubasjonen, sjekk cellene igjen under mikroskopet for å kontrollere at de har riktig festet.48 timer etter såing, fjern forsiktig innsatsen med sterile pinsett og kontroller cellene under mikroskopet for å kontrollere at cellelaget forblir uforstyrret. Fjern mediet fra både nevronen og periventrikulære endotelcelleretter, og legg til en milliliter frisk medium til hver tallerken. Inkuber cellene ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid i fem dager.Deretter fjerner du mediet, fikser cellene med 4% PFA i 10 minutter og vasker dem tre ganger med PBS. For å utføre co-kultur analysen, suspendere 30,000 GABAergic interneurons og 30,000 menneskelige periventrikulære endotelceller i 70 mikroliter av co-kultur medium, deretter frø denne celleløsningen inne i en brønninnsats kupé. Etter 48 timer fjerner du innsatsen.Inkubere co-kulturen ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid i fem dager. Etter inkubasjonen fjerner du mediet, fikser cellene med 4% PFA og vasker dem tre ganger med PBS. For å utføre kjemo-attraksjon analysen, plasser en tre brønn kultur innsats i midten av en poly-L-ornitin og laminin-belagt 35 millimeter parabolen, snu parabolen opp ned, og markere grensen rundt midten av innsatsen ved hjelp av en permanent markør med en ultra fin spiss.Frø 30, 000 GABAergic interneurons i 70 mikroliter av nevronalt medium i mellomrommet, deretter frø 10, 000 periventrikulære endotelceller og 10.000 kontroll endotelceller og 70 mikroliter av sine respektive medium i de to ytre rommene. Tilsett en milliliter med co-kultur medium langs siden av parabolen for å hindre belegget på parabolen fra tørking. Etter 48 timer, fjern innsatsen og inkuber cellene ved 37 grader celsius og 5% karbondioksid i 36 timer.Etter inkubasjonen fjerner du mediet, fikser cellene og vasker dem tre ganger med PBS. Langdistanse- og samkulturmigrasjonsanalyser ble brukt til å undersøke interaksjonene mellom periventrikulære endotelceller og GABAergiske nevroner. I den lange migrasjonsanalysen startet cellene som en rektangulær patch på dag null, men etter 48 timer hadde de migrert ut i det cellefrie rommet.Immunocytokjemisk farging med anti-aktiv caspase-3 antistoff, en markør for apoptose, viste ingen apoptotisk signal i de seedede nevronene. I co-kultur migrasjon analyse, når interneurons ble co-seeded med menneskelige periventrikulære endotelceller, nevroner reiste lengre avstander sammenlignet med når interneurons ble seeded alene eller når co-seeded med kontroll endotelceller. I kjemo-tiltrekningsanalysen migrerte et betydelig høyere antall interneuroner mot periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontroll av endotelceller, noe som bekrefter at GABAergic interneurons reagerer selektivt på kjemo-attraktive signaler utskilles av periventrikulære endotelceller.Disse analysene kan endres ved hjelp av ligander, hemmere eller analyse arenes for å få mekanistisk innsikt i interaksjoner mellom menneskelige periventrikulære endotelceller med menneskelige interneurons. De kan også brukes til å studere samspillet mellom menneskelige periventrikulære endotelceller med andre nevrale celler som rapportert av vår gruppe og andre. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å fikse innsatsen fast på parabolen og holde den uforstyrret gjennom hele analysen, ellers kan det føre til cellelekkasje, celleavløsning eller feiljustering av innsatsen med den tegnede grensen.Vårt arbeid har indikert celle autonom rolle av menneskelige periventrikulære endotelceller i patogenese av psykiatriske lidelser som schizofreni, epilepsi og autisme. Disse analysene vil derfor tillate vurdering av syke periventrikulære endotelceller avledet fra pasienter med disse lidelsene ved hjelp av IPSC-teknologien.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat kortikale nevroner og gliaceller

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Hemmende Synapse Dannelse i en Co-kultur Modell innlemme gabaergic Medium Tifotkreps nevroner og HEK293 Cells stabilt uttrykker GABA<sub&gt; A</sub&gt; Reseptorer

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal rotganglier Nerveceller og Differensiert Adipose-avledet stamceller: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell for å studere Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Opplisting av Neural stamceller Bruke Klonale Analyser

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Metode for høyhastighets strekk skade av menneskelige indusert Pluripotent Stamcelle-avledet Neurons i 96-brønnen Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips

Compartmentalization av Human Stem Cell-avledet neurons innen pre-monterte plast Mikrovæskebasert chips

Use of microfluidic devices to compartmentalize cultured neurons has become a standard method in neuroscience. This protocol shows how to use a ...

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...