Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R44GM113545 en P20GM103434.

Vóór het begin van de dierproeven moet het te gebruiken protocol worden goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC). De goedkeuring van het beschreven protocol werd verkregen via de IACUC aan de Marshall University (Huntington, WV, VS).
1. plasmide ontwerp
<ol><li>Voor het genereren van een genetische deletie met behulp van de pEX100T-NotI plasmide, kloon de gebieden van het DNA flaneren van de gewenste verwijdering sequentie en invoegen in de NotI restrictie plaa...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

De pEX100T-Not1 plasmide is een efficiënte bemiddelaar van sequentiële genomische deleties die marker-vrij en in-frame zijn. Bij het ontwerpen van bacteriële stammen voor verzwakte virulentie, vermindert het verwijderen van volledige genen sequenties in plaats van het genereren van puntmutaties de kans op reversie naar een virulente fenotype. Bovendien verzwakt elke genetische verwijdering van pathogeniteit de pathogenen verder, wat de stabiliteit van de verzwakking versterkt.
Deze methode ...

Pseudomonas aeruginosa is een opportunistisch bacteriële pathogeen dat levensbedreigende ziekten bij de mens kan veroorzaken, vooral in de immuungecompromitteerde. De pathogeniteit van P. aeruginosa is te wijten aan de expressie van vele virulentie factoren, waaronder proteasen en lipopolysaccharide, evenals het vermogen om een beschermende biofilm1te vormen. Vanwege zijn vermogen om virulentie factoren te produceren en ziekte bij de mens veroorzaken, het gebruik van P. aeruginosa om commerciële producten te maken geeft veiligheidsproblemen. Niet-pathogene stammen van E. coli zijn van oudsher gebruikt om bio-ingenieur medische en commerciële producten voor menselijk gebruik. Echter, sommige producten zijn moeilijk voor E. coli te maken, en velen zijn verpakt in inclusie organen, waardoor extractie bewerkelijk. Ontwikkelde bacteriële stammen met de mogelijkheid om te maken en afscheiden van specifieke producten is zeer wenselijk, als afscheiding zou waarschijnlijk verhogen opbrengst en vergemakkelijken zuiveringsprocessen. Zo kunnen niet-pathogene stammen van andere soorten bacteriën (bijv. soorten die meer secretie trajecten gebruiken) nuttige alternatieven bieden voor e. coli. Onlangs rapporteerden we de ontwikkeling van een stam van P. aeruginosa, PGN5, waarbij de pathogeniteit en de toxiciteit van het organisme sterk verzwakte2. Belangrijk is dat deze stam nog steeds grote hoeveelheden van de polysaccharide alginaat produceert, een commercieel interessant onderdeel van de P. aeruginosa biofilm.
De PGN5 stam werd gegenereerd met behulp van een twee-stappen allel uitwisseling procedure met de pEX100T-noti plasmide om opeenvolgend verwijderen van vijf genen (Toxa, Plch, phzm, wapr, aroA) bekend om bij te dragen aan de pathogeniteit van het organisme. pEX100T-noti werd gegenereerd door de smai te veranderen in een noti restrictie enzym herkennings locatie binnen de meervoudige kloon site van de plasmide pEX100T, die werd ontwikkeld in het laboratorium van Herbert Schweizer3,4. De herkennings locatie voor het beperkings enzym NotI is een zeldzamer DNA-sequentie vergeleken met SmaI en is minder waarschijnlijk aanwezig in sequenties die gekloond worden, dus het is handiger voor kloon doeleinden. Het plasmide draagt genen die het mogelijk maken om te selecteren, met inbegrip van het bla -gen, dat ß-lactamase codeert en resistentie verleent aan carbenicillin, en het b. subtilissacB -gen, dat de gevoeligheid voor sucrose toekent (Figuur 1A). Het plasmide heeft ook een oorsprong van replicatie (ori) compatibel met E. coli, en een oorsprong van overdracht (orit) die het mogelijk maakt voor plasmide overdracht van E. coli naar Pseudomonas soorten via conjugatie. Echter, het plasmide mist een oorsprong van replicatie verenigbaar met Pseudomonas, en dus kan niet repliceren binnen Pseudomonas soorten (dat wil zeggen, het is een Pseudomonas Suicide vector). Deze kenmerken maken pEX100T-NotI ideaal voor het targeten van genetische verwijderingen van het Pseudomonas -chromosoom. Plasmide klonen stappen worden uitgevoerd met behulp van E. coli en de resulterende plasmide wordt overgebracht naar Pseudomonas door transformatie of conjugatie. Vervolgens wordt, via homologeuze recombinatie gebeurtenissen en selectieve stappen, de beoogde verwijdering in het frame gegenereerd, vrij van markeringen. Deze methode voor het sequentieel verwijderen van genomische gebieden uit het chromosoom van P. aeruginosa kan worden gebruikt voor het genereren van sterk verzwakte Pseudomonas stammen, zoals PGN5, of voor het ontwerpen van stammen voor andere specifieke toepassingen (bijv. stammen tekort aan enzym voor plasmide vermeerdering of stammen tekort aan proteasen voor de productie van eiwitten van belang).
De algehele virulentie van bacteriestammen wordt beïnvloed door groeiomstandigheden en-fasen, waarbij mutaties vaak voorkomen. Daarom kan het meten van de veiligheid van genetisch gemanipuleerde stammen een uitdaging zijn. Om bacteriële isolaten te evalueren voor systemische virulentie, hebben we een eerder gepubliceerd Protocol van infectie aangepast door intraperitoneale injectie van C57BL/6 muizen5. We hebben deze procedure gewijzigd om bevroren bacteriële voorraden voor injectie te gebruiken, wat een precieze dosering en eenvoudige validering van de gebruikte stammen toestaat. In dit model, de E. coli stam BL21, die is goedgekeurd door de FDA voor de productie van Biopharmaceuticals, werd gebruikt als een controle veiligheidsstandaard voor het bepalen van de relatieve pathogenese van de stam6,7,8. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze methode is dat het reproduceerbaar is en minimaliseert bronnen van variatie, als infecterende stammen worden gevalideerd voor bacteriële cel nummer, fenotype, en genetische markers zowel voor als na infectie. Met deze gecontroleerde stappen wordt het aantal benodigde dieren verlaagd. In dit model, P. aeruginosa stammen die resulteren in C57BL/6 Murine sterftecijfers gelijk aan of minder dan E. coli BL21 wanneer geïnjecteerd intraperitoneaal kan worden beschouwd als verzwakte. Dit eenvoudige muismodel van infectie kan ook worden gebruikt om de verzwakte pathogeniteit van genetisch gemanipuleerde stammen van andere soorten te beoordelen met behulp van de door de FDA goedgekeurde E. coli -stam als referentie. Stappen 1-7 detail het genereren van sequentiële genomische verwijderingen in p. aeruginosa (Figuur 1) en stappen 8-12 detail het gebruik van een muismodel om de pathogeniteit van p. aeruginosa stammen te testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Micro-organismen zijn genetisch veelzijdig en divers en zijn uitgegroeid tot een belangrijke bron van vele commerciële producten en Biopharmaceuticals. Hoewel sommige van deze producten natuurlijk worden geproduceerd door de organismen, vereisen andere producten genetische manipulatie van het organisme om de productie opbrengsten te verhogen. Avirulente stammen van Escherichia coli zijn van oudsher de voorkeur bacteriesoorten voor de productie van Biopharmaceuticals; echter, sommige producten zijn moeilijk voor E. coli te produceren. Zo kunnen Avirulente stammen van andere bacteriesoorten nuttige alternatieven bieden voor de productie van sommige commerciële producten. Pseudomonas aeruginosa is een veel voorkomende en goed bestudeerde gram-negatieve bacterie die een geschikt alternatief voor E. colizou kunnen bieden. Echter, P. aeruginosa is een opportunistisch humaan pathogeen. Hier, we gedetailleerd een procedure die kan worden gebruikt voor het genereren van niet-pathogene stammen van P. aeruginosa door sequentiële genomische verwijderingen met behulp van de PEX100T-noti plasmide. Het belangrijkste voordeel van deze methode is om een marker-vrije stam te produceren. Deze methode kan worden gebruikt voor het genereren van sterk verzwakte P. aeruginosa stammen voor de productie van commerciële producten, of voor het ontwerpen van stammen voor andere specifieke toepassingen. We beschrijven ook een eenvoudig en reproduceerbaar muismodel van bacteriële systemische infectie via intraperitoneale injectie van gevalideerde test stammen om de verzwakking van de genetisch gemanipuleerde stam te testen in vergelijking met de door de FDA goedgekeurde BL21 stam van E. coli.

Zoals weergegeven in Figuur 2, kan de beoogde genomische verwijdering worden bevestigd met behulp van kolonie PCR met specifieke primers die het gebied van belang versterken. Kolonies die een genomische deletie dragen, zullen een kortere PCR-band grootte opleveren in vergelijking met wild-type kolonies. Een PCR-scherm van 10-12 kolonies is meestal voldoende om ten minste één kolonie te detecteren die de beoogde verwijdering draagt. Als er na meerdere rondes...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.

Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Dit protocol is belangrijk voor het creëren en bepalen van geest-lichaam gewenste mutaties in het genoom van Pseudomonas aeruginosa, evenals het testen van het effect van mutaties op virulentiereductie in een reproduceerbaar muismodel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een chroomvalidatie en een reproduceerbaarheid van muisinfectiemodel. Bacteriën werken voortdurend, voortdurend veranderen.Om dit proces te vertragen, gebruiken we een bevroren stops, verpakken ze, hangen ze op meerdere sporten aan modificatie voordat we ze testen in het muismodel. Iemand die niet bekend is met deze methoden zal waarschijnlijk worstelen met de ontwikkeling en selectie van mogelijke crossover recombinant te testen. Bovendien zal de behandeling van de muizen voor infectie moeilijk zijn voor iemand die niet bekend is met dierlijk werk.Deze methode kan worden toegepast op het testen van andere ziekteverwekkers en hun mutanten, evenals virulentie infecteren bij muizen. Vergeleken met de huidige modellen, procedures met reproduceerbaarheid plus kloon validatie voor en na infectie kan profiteren van andere onderzoekers in het veld. Visuele demonstratie van dit protocol geeft inzicht in uitgebreide procedures die moeilijk te begrijpen of te begrijpen zijn door alleen te lezen.Begin met het kweken van enkele crossover, recombinant kolonies in Pseudomonas Isolation Broth, of PIB. Inenting en streep 10 microliter van elke cultuur op voorverwarmde PIA-platen, aangevuld met 10%sucrose. Dan incubeer de platen 's nachts op 37 graden Celsius.Verwijder de platen de volgende dag uit de couveuse en inspecteer ze op groei. De sacharosebestendige kolonie moet dubbele crossover recombinanten zijn. Gebruik steriele tandenstokers om ten minste 20 kolonies te patchen op voorverwarmde platen van PIA, PIA aangevuld met 10%sucrose en PIA aangevuld met carbenicilline.Broed de platen 's nachts en onderzoeken ze voor de groei op de volgende dag. Echte dubbele crossover recombinanten zullen carbenicilline-gevoelig en sacharose-resistent zijn. Scherm 10 tot 20 kolonies voor verwijdering, met behulp van kolonie PCR.Pak de groei van een vermoedelijke dubbele crossover recombinant met een steriele tandenstoker en schort het op in 50 microliters van PBS. Kook de suspensie 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifuge het drie minuten op 13.000 keer G en leg het op ijs.Voer vervolgens PCR uit volgens de aanwijzingen van het manuscript. Zodra PCR klaar is, voer Agarose gel elektroforese op de producten. Kleinere versterkingsproducten geven kolonies aan waarin het interessegebied is verwijderd.Ontdooi op de ochtend van injecties de cryovials van bacteriële cellen bij vier graden Celsius gedurende drie tot vier uur. Houd de flesjes op ijs na het ontdooien en injecteer de muizen binnen twee uur. Breng de inhoud van elke cryovial over naar een nieuwe twee milliliter buis en centrifugeer het op 4, 500 keer G gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op in één milliliter PBS. Herhaal de centrifugatie en schort de cellen in PBS opnieuw op tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 keer 10 tot de negende kolonievormende eenheden per milliliter. Neem drie monsters van de laatste suspensie van elke stam om concentratie, genotype en fenotype te valideren.Voor elke stam, aliquot 1,5 milliliter van de cel suspensie in een twee milliliter buis en bereid de PBS voor controle injecties. Verzamel de muizen en materialen die nodig zijn voor injecties in een steriele dierlijke chirurgische ruimte en veeg alle oppervlakken met ontsmettingsdoekjes voordat u begint. Draag twee paar latex handschoenen om het risico op punctie te beperken, indien gebeten, evenals een labjas, veiligheidsbril en gezichtsmasker.Haal de muis uit de kooi en weeg hem, waardoor de staart wordt gemerkt met permanente markering voor het volgen na de injectie. Open een nieuwe een milliliter spuit met een 27-meter naald en het opstellen van 200 microliter van steriele PBS. Pak de muis achter zijn oren, met behulp van de duim en wijsvinger, en knijp om een huidplooi te creëren op de nek.Zet vervolgens de staart in de palm met behulp van de pink om de muis plat en onbeweeglijk te houden. Plaats de naald in een hoek van 30 graden in de buikholte links of rechts van de middellijn. Til de naald iets op om ervoor te zorgen dat deze niet in organen is ingebracht.Injecteer vervolgens langzaam de PBS en trek de naald terug. Een bolus op de injectieplaats is typisch. Plaats de naald in de aangewezen slijpcontainer en verplaats de muis naar een aparte kooi.Herhaal de procedure met de volgende muis en nadat alle muizen uit de ene kooi zijn geïnjecteerd, verplaats ze terug naar hun oorspronkelijke kooi. Na het injecteren van de controlegroep, injecteer de testgroepen met dezelfde procedure. Zodra alle injecties zijn voltooid, breng de muizen terug naar de behuizing en maak het werkgebied schoon met ontsmettingsdoekjes.Om de dieren in beeld te brengen, bereidt u het beeldsysteem voor door de cameraparameters in te stellen en het podium te verwarmen. Stel de zuurstofstroom in op 1,5 liter per minuut en isoflurane op 3,5% en beweeg de muis naar de verdovingskamer, vervolgens naar het temperatuur gestabiliseerde stadium, na anesthesie. Plaats de muis op zijn rug met uitgestrekte armen en pas een neuskegel aan voor toediening van 2,5% isoflurane tijdens beeldvorming.Sluit de deur en maak bioluminescente beelden en röntgenfoto's van de muis. Wanneer de beeldvorming is voltooid, breng de muis terug naar zijn kooi en controleer deze. Het moet binnen drie tot vijf minuten weer bij bewustzijn komen.De gerichte genomische deleties werden bevestigd door kolonie PCR met specifieke primers die de regio van belang versterkt. De kolonies met de genomic schrapping opbrengst een kortere band PCR in vergelijking met wilde typekolonies. Intraperitoneale injectie van de verzwakte stam van P aeruginosa, PGN vijf, resulteerde in 0%-mortaliteit, gelijk aan sterfte waargenomen met E.coli BL 21.Injectie van de ouderstam was echter fataal voor 80% van de muizen. Infectie progressie werd bijgehouden met behulp van bioluminescentie gemarkeerde ouder en verzwakte stammen. De verzwakte stam bleef gelokaliseerd op de injectieplaats tot de bioluminescentie vervaagde, wat waarschijnlijk samenviel met de klaring van de infectie.De gepresenteerde methode onderzocht alleen de sterfte die door de stam wordt veroorzaakt. Meer diepgaande immunologische en toxicologische aspecten kunnen worden gebruikt om de dynamiek van infectie te bepalen en het eindeffect van de infectie heeft dat niet leidt tot de dood. Het belangrijkste in de procedure is de uitgebreide validatie gedaan, tussen verschillende stappen van de eerste identificatie tot dierproeven.Het missen van bepaalde validatiestappen kan mogelijk leiden tot een verkeerd resultaat, omdat de geteste stammen een mutatie en selectie kunnen ondergaan of besmet kunnen raken. Met de ontwikkeling van deze twee technieken, denken we dat dit onze onderzoekers op het gebied van infectie immunologie in staat zal stellen om effectiever te onderzoeken hoe krachtige pakketinteractie leidt tot het extreme fenotype, sepsis en mortaliteit. De impact van verschillende voedingsstoffen op varianten kan worden vergeleken door middel van grootteding van bacteriën.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa en Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow cellen

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Aan de kant van licht komen: In Vivo Monitoring van Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecties in chronische wonden in een diabetische haarloze lymfkliertest Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Een vertraagde inenting model van chronische Pseudomonas aeruginosa wondinfectie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...