Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
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이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.

동물 실험을 시작하기 전에 사용할 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받아야합니다. 설명된 프로토콜에 대한 승인은 마샬 대학교(미국 헌팅턴, WV)의 IACUC를 통해 획득되었습니다.
1. 플라스미드 디자인
<ol><li>pEX100T-NotI 플라스미드를 사용하여 유전적 결실을 생성하기 위해, 원하는 결실 서열을 측면으로 하는 DNA 의 영역을 복제하고 플라스미드의 NotI ?...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

pEX100T-Not1 플라스미드는 마커가 없고 프레임 내에 있는 순차적 게놈 제거의 효율적인 중재자입니다. 감쇠된 독성을 위한 세균성 긴장을 기술할 때, 점 돌연변이를 생성하는 보다는 오히려 전체 유전자 순서의 삭제는 악성 표현형으로 복귀의 가능성을 감소시다. 추가적으로, 각 병원성 유전자 삭제는 감쇠의 안정성을 강화, 병원체를 더 감쇠합니다.
이 방법은 또한 플라스미드 ...

슈도모나스 녹농균은 인간, 특히 면역 손상에서 생명을 위협하는 질병을 일으킬 수있는 기회 세균성 병원체입니다. P. aeruginosa의 병원성은 프로테아제 및 리포폴리사카라이드를 포함한 많은 독성 인자의 발현뿐만 아니라 보호생물막을형성하는 능력에 기인한다 1. 때문에 독성 요인을 생성하고 인간에서 질병을 일으킬 수있는 능력, 상용 제품을 만들기 위해 P. aeruginosa를 사용하여 안전 문제를 제시. 대장균의 비병원성 균주는 전통적으로 인간의 사용을 위해 의료 및 상업용 제품을 생체 공학하는 데 사용되어 왔습니다. 그러나 일부 제품은 대장균을 만들기가 어렵고, 많은 제품이 포함 기관에 포장되어 추출이 힘들다. 특정 제품을 만들고 분비할 수 있는 능력을 가진 엔지니어링된 세균성 균주는 수율을 증가시키고 정화 과정을 용이하게 하기 때문에 매우 바람직합니다. 따라서, 다른 종의 박테리아(예를 들어, 더 많은 분비 경로를 이용하는 종)의 비병원성 균주는 대장균에유용한 대안을 제공할 수 있다. 우리는 최근에 유기체의 병원성 및 독성이 고도로 감쇠되는 P. aeruginosa,PGN5의 균주의 발달을 보고했다2. 중요한 것은, 이 균주는 여전히 다당류 알긴산, P. aeruginosa 생물막의 상업적으로 흥미로운 성분을 대량생산한다.
PGN5 균주는 5개의유전자(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)를순차적으로 삭제하기 위해 pEX100T-NotI 플라스미드와 2단계 알레릭 교환 절차를 사용하여 생성되었으며, 이는 유기체의 병원성에 기여하는 것으로 알려져 있다. pEX100T-NotI는 허버트 슈바이저의 실험실3,4에서개발된 플라스미드 pEX100T의 다중 복제 부위 내에서 Ti 제한 효소 인식 부위로 SmaI를 변경하여 생성되었다. 제한 효소 NotI에 대한 인식 부위는 SmaI에 비해 드문 DNA 서열이며 복제되는 서열에 존재할 가능성이 적고, 따라서 복제 목적으로 더 편리하다. 플라스미드는 카르베니실린에 대한 저항성을 부여하는 ß-lactamase를 인코딩하고 카르베니실린에 대한 저항성을 부여하는 블라 유전자와 자당에 대한 민감성을 부여하는 B. subtilissacB 유전자를 포함하여 선택을 허용하는 유전자를 운반합니다(그림 1A). 플라스미드는 또한 대장균과호환되는복제(ori)의기원을 가지고 있으며, 대장균에서 슈도모나스 종으로 플라스미드 이송을 허용하는 이송(oriT)의 기원을 컨쥬게이션을 통해 전달한다. 그러나, 플라스미드는 슈도모나스와호환되는 복제의 기원이 결여되어 있으며, 따라서 슈도모나스 종 내에서 복제할 수 없다(즉, 슈도모나스 자살 벡터). 이러한 특성은 pEX100T-NotI를 슈도모나스 염색체로부터의 유전자 삭제를 표적으로 하는 데 이상적입니다. 플라스미드 클로닝 단계는 대장균을 사용하여 수행되고 결과 플라스미드는 변형 또는 컨쥬게이션에 의해 슈도모나스로 이송된다. 그런 다음, 상동 재조합 이벤트 및 선택적 단계를 통해, 표적 인프레임 삭제가 생성되고, 마커가 없는. P. aeruginosa의 염색체에서 게놈 지구를 순차적으로 삭제하는 이 방법은 PGN5같이 고도로 감쇠된 슈도모나스 균주를 생성하거나, 다른 특정 용도를 위한 균주를 설계하는 데 사용될 수 있습니다(예를 들어, 단백질의 플라스미드 전파 또는 균주 결핍에 대한 종부 결핍균에 대한 균주 결핍).
박테리아의 긴장의 전반적인 독성은 돌연변이가 빈번히 생기는 동안 성장 조건 및 단계에 의해 영향을 받습니다. 따라서 유전자 조작 균주의 안전도를 측정하는 것은 어려울 수 있습니다. 전신 독성에 대한 세균 분리를 평가하기 위해, 우리는 C57BL/6 마우스5의복강 내 주사에 의한 감염의 이전에 발표된 프로토콜을 적용하였다. 우리는 주입을 위해 냉동 세균성 주식을 사용하기 위하여 이 절차를 수정했습니다, 사용된 긴장의 정확한 주입 그리고 쉬운 검증을 허용했습니다. 이 모델에서, 바이오 의약품의 생산을 위해 FDA 승인을받은 대장균 균주 BL21은, 균주6,7,8의상대적인 병인을 결정하기 위한 제어 안전성 표준으로 사용되었다. 이 방법을 사용하는 주요 장점은 감염 균주가 감염 전후 의 세균 세포 수, 표현형 및 유전 마커에 대해 검증되기 때문에 재현 가능하고 변이의 근원을 최소화한다는 것입니다. 이러한 제어 단계를 통해 필요한 동물의 수가 줄어듭니다. 이 모델에서, C57BL/6 murine 사망률을 초래하는 P. aeruginosa 균주는 복강 내 주입시 대장균 BL21보다 동일하거나 더 적은 것으로 간주될 수 있다. 감염의 이 간단한 마우스 모형은 또한 참조로 FDA 승인된 대장균 긴장을 사용하여 그밖 종에게서 유전으로 조작된 긴장의 감쇠된 병원성을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 단계 1-7은 P. aeruginosa에서 순차적 게놈 결실의 생성을 상세히(도 1)및 단계 8-12 단계는 P. aeruginosa 균주의 병원성을 시험하기 위하여 마우스 모형의 사용을 상세히.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

미생물은 유전적으로 다재다능하고 다양하며 많은 상용 제품 및 바이오 의약품의 주요 공급원이 되었습니다. 이러한 제품 중 일부는 자연적으로 유기체에 의해 생산되지만, 다른 제품은 생산의 수율을 높이기 위해 유기체의 유전 공학을 필요로한다. 대장균의 Avirulent 균주는 전통적으로 바이오 의약품을 생산하기위한 바람직한 세균 종이었다; 그러나 일부 제품은 대장균을 생산하기가 어렵습니다. 따라서, 다른 세균성 종의 avirulent 긴장은 몇몇 상업적인 제품의 생산을 위한 유용한 대안을 제공할 수 있었습니다. 슈도모나스 녹농균은 대장균에적합한 대안을 제공할 수 있는 일반적이고 잘 연구된 그람 음성 박테리아입니다. 그러나, P. aeruginosa는 기회 인간 병원체입니다. 여기서, 우리는 pEX100T-NotI 플라스미드를 이용한 순차적 게놈 삭제를 통해 P. aeruginosa의 비병원성 균주를 생성하는데 사용될 수 있는 절차를 상세히 설명한다. 이 방법의 주요 장점은 마커없는 변형을 생성하는 것입니다. 이 방법은 상용 제품의 생산을 위한 고도로 감쇠된 P. aeruginosa 균주를 생성하거나, 또는 다른 특정 용도를 위한 균주를 설계하기 위하여 이용될 수 있다. 우리는 또한 대장균의 FDA 승인 BL21 긴장에 비해 유전자 조작 균주의 감쇠를 테스트하기 위해 검증 된 테스트 균주의 복강 내 주입을 통해 세균 성 전신 감염의 간단하고 재현 가능한 마우스 모델을 설명합니다.

도 2에도시된 바와 같이, 표적 게놈 결실은 관심 영역을 증폭시키는 특정 프라이머와 함께 콜로니 PCR을 사용하여 확인할 수 있다. 게놈 결실을 전송하는 식민지는 야생 형 식민지에 비해 더 짧은 PCR 대역 크기를 산출할 것입니다. 10-12 개의 식민지의 PCR 스크린은 일반적으로 표적 삭제를 전송하는 적어도 1개의 식민지를 검출하기 위하여 충분합니다. ?...

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Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형 균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

이 프로토콜은 슈도모나스 아에루기노사의 게놈에서 마음-몸 원하는 돌연변이를 만들고 결정하는 데 중요하며, 재현 가능한 마우스 모델의 독성 감소에 대한 돌연변이의 효과를 테스트하는 데 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 크롬 유효성 검사 및 마우스 감염 모델의 재현성입니다. 박테리아는 지속적으로 작동, 지속적으로 변화.이 과정을 늦추기 위해, 우리는 냉동 정지를 사용, 가방, 마우스 모델에서 그들을 테스트하기 전에 수정에 여러 렁에 걸. 이러한 방법에 익숙하지 않은 사람은 테스트 할 수있는 크로스 오버 재조합의 개발 및 선택에 가장 가능성이 어려움을 겪을 것입니다. 더욱이, 감염을 위한 마우스의 취급은 동물 작용에 익숙하지 않은 누군가를 위해 어려울 것입니다.이 방법은 그밖 병원체 및 그들의 돌연변이를 시험하기 위하여 적용될 수 있고, 뿐만 아니라 독성은 마우스에 있는 감염합니다. 현재 모델에 비해, 감염 전후 의 재현성 플러스 클론 검증을 가진 절차는 필드에 있는 그밖 조사자에게 유익할 수 있습니다. 이 프로토콜의 시각적 데모는 읽기만으로 이해하기 어렵거나 이해하기 어려울 수 있는 광범위한 절차에 대한 통찰력을 제공합니다.슈도모나스 격리 국물 또는 PIB에서 단일 크로스 오버, 재조합 식민지를 성장하여 시작합니다. 10%의 자당으로 보충된 사전 데운 PIA 플레이트에 각 배양의 10 마이크로리터를 접종하고 줄무늬로 합니다. 그런 다음 하룻밤 동안 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다.다음 날, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장을 검사합니다. 자당 저항 하는 식민지 이중 크로스 오버 재조합 이어야 한다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 최소 20개의 콜로니를 PIA의 미리 데운 접시에 패치하고, PIA는 10%의 자당으로 보충되고, CARbenicillin으로 보충된 PIA를 사용합니다.하룻밤 동안 접시를 배양하고 다음 날 성장을 위해 그들을 검사합니다. 진정한 이중 크로스오버 재조합은 카베니실린에 민감하고 자당에 강합니다. 콜로니 PCR을 사용하여 삭제를 위해 10~20개의 콜로니를 화면으로 검사합니다.멸균 이쑤시개를 가진 의심되는 이중 크로스 오버 재조합의 성장을 선택하고 PBS의 50 마이크로 리터에서 그것을 중단하십시오. 서스펜션을 섭씨 100도에서 10분간 끓입니다. 원심 분리기는 13, 000배 G에서 3분간 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 원고 방향에 따라 PCR을 수행합니다. PCR이 완료되면 제품에 아가로즈 젤 전기 전도를 수행하십시오. 더 작은 증폭 제품은 관심 영역이 삭제된 식민지를 나타냅니다.주사의 아침에, 3 ~ 4 시간 동안 섭씨 4도에서 세균 세포의 극저온을 해동. 해동 후 얼음에 바이알을 유지하고 2 시간 이내에 마우스를 주입하십시오. 각 극저온의 내용을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기는 4, 500회 G에서 10분 동안 전달합니다.상체를 버리고 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리를 반복하고 PBS에서 세포를 밀리리터당 9번째 콜로니 형성 단위로 2.5배 10배의 최종 농도로 다시 중단한다. 각 균주의 최종 현탁액에서 3개의 샘플을 채취하여 농도, 유전자형 및 표현형을 검증합니다.각 균주에 대해, 2 밀리리터 튜브로 세포 현탁액의 알리쿼트 1.5 밀리리터를 대조주사용 PBS를 준비한다. 멸균 동물 외과실에서 주사에 필요한 마우스와 재료를 수집하고 시작하기 전에 물티슈로 모든 표면을 닦아냅니다. 라텍스 장갑 2켤레를 착용하여 물린 경우 펑크의 위험을 제한하고 실험실 코트, 안전 안경 및 얼굴 마스크를 착용하십시오.케이지에서 마우스를 제거하고 무게를 측정하여 주사 후 추적을 위한 영구 마커로 꼬리를 표시합니다. 27 게이지 바늘로 새로운 1 밀리리터 주사기를 열고 멸균 PBS200 마이크로리터를 그립니다. 마우스를 귀 뒤에 잡고 엄지와 집게 손가락을 사용하여 꼬집어 목의 목덜미에 피부 주름을 만듭니다.그런 다음, 마우스를 평평하게 잡고 움직이지 않는 핑키를 사용하여 손바닥에 꼬리를 고정하십시오. 바늘을 30도 각도로 중간라인의 왼쪽 또는 오른쪽으로 복막 구멍에 삽입합니다. 바늘을 약간 들어 올려 장기에 삽입되지 않았는지 확인합니다.그런 다음, 천천히 PBS를 주입하고 바늘을 철회. 주사 부위의 볼루스는 일반적입니다. 지정된 날카로운 폐기 용기에 바늘을 놓고 마우스를 별도의 케이지로 옮습니다.다음 마우스로 절차를 반복하고 한 케이지의 모든 마우스가 주입 된 후 원래 케이지로 다시 이동합니다. 대조군을 주입한 후 동일한 절차를 사용하여 테스트 그룹을 주입합니다. 모든 주사가 완료되면 마우스를 하우징 룸으로 돌려보내 위생 물티슈로 작업 영역을 청소하십시오.동물을 이미지화하려면 카메라 매개 변수를 설정하고 스테이지를 가열하여 이미징 시스템을 준비합니다. 산소 흐름을 분당 1.5리터로 설정하고 이소플루란을 3.5%로 설정하고 마우스를 마취실로 옮은 다음 마취 후 온도 안정화 단계로 이동합니다. 팔을 뻗은 마우스를 등에 놓고 이미징 중에 2.5 %의 이소플루란을 투여하기 위해 코 콘에 맞습니다.문을 닫고 마우스의 생체 발광 이미지와 엑스레이를 찍습니다. 이미징이 완료되면 마우스를 케이지로 반환하고 모니터링합니다. 그것은 3 ~ 5 분 이내에 의식을 회복해야합니다.표적 게놈 삭제는 관심 있는 지역을 증폭시킨 특정 프라이머를 가진 식민지 PCR에 의해 확인되었습니다. 유전체 삭제를 가진 식민지는 야생 형 식민지에 비해 짧은 PCR 밴드를 산출한다. P aeruginosa, PGN 5의 감쇠 된 균주의 인과 간 주사는 대장균 BL 21로 관찰 된 사망률과 동등한 0 %의 사망률을 초래했습니다.그러나 부모 균주의 주입은 마우스의 80%에 치명적이었습니다. 감염 진행은 생물 발광 표시 부모와 감쇠된 긴장을 사용하여 추적되었습니다. 감쇠된 긴장은 생물 발광이 희미해질 때까지 주사 부위에 국한된 남아 있었습니다, 이는 가능성이 감염의 간격과 일치합니다.제시된 방법은 균주에 의해 생성된 사망률을 검사했습니다. 보다 심층적인 면역학적 및 독성적 측면은 감염의 역학과 감염이 사망을 초래하지 않는 최종 효과를 결정하기 위해 활용될 수 있다. 절차에서 가장 중요한 것은 초기 식별에서 동물 실험에 이르기까지 다양한 단계 간에 광범위한 검증이 수행된다는 것입니다.시험된 균주가 돌연변이 및 선택을 겪거나 오염될 수 있기 때문에 특정 유효성 검사 단계를 놓치면 잠재적으로 잘못된 결과로 이어질 수 있습니다. 이 두 기술의 발달로, 우리는 이것이 감염 면역학의 필드에 있는 우리의 연구원이 극단적인 표현형, 패혈증 및 사망에 어떻게 강력한 포장 상호 작용이 이끌어 내는지 보다 효과적으로 조사하는 것을 허용할 것이라고 생각합니다. 변이체에 대한 다른 영양소의 영향은 박테리아의 크기 주체를 통해 비교할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...