Name: generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

Hayvan deneyleri başlamadan önce kullanılacak protokol Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Açıklanan protokolün onayı Marshall Üniversitesi'ndeki (Huntington, WV, ABD) IACUC aracılığıyla alındı.
1. Plazmid Tasarımı
<ol><li>pEX100T-NotI plazmidkullanarak genetik bir silme oluşturmak için, istenilen silme sırasını çevreleyen DNA bölgelerini klonlamak ve plazmidin NotI kısıtlama bölgesine yerleştirin. Plazmid kesici uç, ...

<ol>
	<li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate.">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li><li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa.">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li><li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis.">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li><li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+(sigmaE).">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li><li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li><li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production.">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).</li><li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals.">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).</li><li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+splicing+by+overlap+extension:+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction.">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes:+gene+splicing+by+overlap+extension.">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans.">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells:+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation.">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li><li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions.">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209 (2010).</li><li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria:+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440.">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li><li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli.">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li><li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria.">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li><li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+and+prospects+of+microbial+preservation.">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li></ol>

pEX100T-Not1 plazmid, marker içermeyen ve çerçeve içi ardışık genomik silmelerin etkili bir aracısi. Bakteri suşları zayıflatılmış virülans için mühendislik zaman, nokta mutasyonları üreten yerine tüm gen dizilerinin silinmesi öldürücü bir fenotip reversiyon olasılığını azaltır. Ayrıca, her patojengen delemesi patojeni daha da zayıflatarak zayıflama nın stabilitesini güçlendirir.
Bu yöntem aynı zamanda sadece plazmid kesici uç tasarımıdeğiştirerek, no...

Pseudomonas aeruginosa insanlarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir fırsatçı bir bakteriyel patojen, özellikle immunocompromised. P. aeruginosa patojenite proteazlar ve lipopolisakkarit de dahil olmak üzere birçok virülans faktörlerin ifade kaynaklanmaktadır, yanı sıra koruyucu bir biyofilm oluşturmak için yeteneği1. Virülans faktörleri üretme ve insanlarda hastalığa neden olma becerisi nedeniyle, P. aeruginosa'yı ticari ürünler yapmak için kullanmak güvenlik kaygılarını da ortaya çıkarmaktadır. E. coli nonpatojenik suşları geleneksel olarak insan kullanımı için tıbbi ve ticari ürünlerin biyomühendisliğinde kullanılmaktadır. Ancak, bazı ürünler E. coli yapmak zordur, ve birçok ekleme organları paketlenmiş, çıkarma zahmetli hale. Salgıverim büyük olasılıkla verimi artırmak ve arıtma süreçlerini kolaylaştırmak gibi, belirli ürünler yapmak ve salgılamak yeteneği ile tasarlanmış bakteriyel suşları, son derece arzu edilir. Böylece, diğer bakteri türlerinin patojenik olmayan suşları (örneğin, daha fazla salgı yolları kullanan türler) E. coli'yeyararlı alternatifler sağlayabilir. Biz son zamanlarda P. aeruginosabir suşu gelişimi rapor , PGN5, hangi organizmanın patojenitesi ve toksisitesi yüksek zayıflatılmış2. Daha da önemlisi, bu tür hala polisakkarit aljinat büyük miktarlarda üretir, P. aeruginosa biyofilm ticari olarak ilginç bir bileşeni.
PGN5 suşu, organizmanın patojenitesine katkıda bulunduğu bilinen beş geni(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)sırayla silmek için pEX100T-NotI plazmid ile iki aşamalı bir allelik değişim prosedürü kullanılarak oluşturuldu. pEX100T-NotI Plazmid pEX100T, Herbert Schweizer's labgeliştirilenbirden fazla klonlama sitesi içinde bir NotI restriksiyon enzim tanıma sitesi SmaI değiştirerek oluşturuldu3 ,4. Restriksiyon enzimi NotI için tanıma sitesi SmaI ile karşılaştırıldığında daha nadir bir DNA dizisidir ve klonlanan dizilerde bulunma olasılığı daha düşüktür, bu nedenle klonlama amacıyla daha uygundur. Plazmid, ß-laktamaz kodlayan ve karbenisin direncini ortaya koyan bla geni ve sakaroza duyarlılık sağlayan B. subtilissacB geni de dahil olmak üzere seçime olanak sağlayan genleri taşır (Şekil 1A). Plazmid aynı zamanda E. coliile uyumlu çoğaltma(ori)ve konjugasyon yoluyla E. coli'den Pseudomonas türlerine plazmid transferine izin veren transferin(oriT)kökenini de taşır. Ancak, plazmid Pseudomonasile uyumlu çoğaltma bir kökeni yoksun , ve böylece Pseudomonas türleri içinde çoğaltmak olamaz (yani, bir Pseudomonas intihar vektörü). Bu özellikler pEX100T-NotI'yi Pseudomonas kromozomundaki genetik silmeleri hedeflemek için ideal kılmıştır. Plazmid klonlama adımları E. coli kullanılarak gerçekleştirilir ve ortaya çıkan plazmid dönüşüm veya konjugasyon ile Pseudomonas aktarılır. Daha sonra, homolog rekombinasyon olayları ve seçici adımlar sayesinde, hedeflenen çerçeve içi silme, işaretleyicisiz oluşturulur. P. aeruginosa kromozomundan genomik bölgeleri sırayla silebilmek için bu yöntem PGN5 gibi yüksek oranda zayıflatılmış Pseudomonas suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir (örn. plazmid yayılımı için enforükleazlarda eksik suşlar veya ilgi proteinlerinin üretimi için protelazlarda eksik suşlar).
Bakteri suşlarının genel virülansı büyüme koşulları ve evrelerinden etkilenir ve bu süre zarfında mutasyonlar sık görülür. Bu nedenle, genetiği değiştirilmiş suşların güvenliğini ölçmek zor olabilir. Sistemik virülans için bakteriyel izole değerlendirmek için, C57BL/6 fareler5intraperitoneal enjeksiyon u tarafından daha önce yayınlanmış bir enfeksiyon protokolü uyarlanmış. Bu prosedürü, kullanılan suşların hassas dosupve kolay doğrulanmasına olanak sağlayan enjeksiyon için dondurulmuş bakteri stokları kullanmak üzere modifiye ettik. Bu modelde, Biyofarmasötik üretimi için FDA onaylı olan E. coli suşu BL21, suş göreceli patogenezi belirlemek için bir kontrol güvenlik standardı olarak kullanılmıştır6,7,8. Bu yöntemi kullanmanın en büyük avantajı, enfeksiyon öncesi ve sonrası bakteri hücre numarası, fenotip ve genetik belirteçler için doğrulanmış olan bulaşma suşları, tekrarlanabilir olması ve varyasyon kaynaklarını en aza indirmesidir. Bu kontrollü adımlarla gerekli hayvan sayısı azalır. Bu modelde, enjekte edilen intraperitoneally e. coli BL21'e eşit veya daha az C57BL/6 murine mortalite oranlarına neden olan P. aeruginosa suşları zayıflatılmış kabul edilebilir. Bu basit fare enfeksiyonu modeli, referans olarak FDA onaylı E. coli suşunu kullanarak diğer türlerden genetik olarak tasarlanmış suşların zayıflatılmış patojenliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. 1-7. adımlar P. aeruginosa (Şekil 1)ve 8-12 adımlarında sıralı genomik silmelerin oluşumunu ayrıntılı olarak inceleyin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL tubes with flat caps</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>22-253-260</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable polystyrene cuvette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic Vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-821-13B</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu block Digital Dry Bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>NC0205808</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge 5804R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>04-987-372</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>75-003-287</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Test Tube, Polystyrene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-956-6D</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Inoculation Loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy UltraClean Microbial Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12224-50</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>D6493-01</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes</td>
			<td>Bulldog Bio</td>
			<td>NC0492929</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastLink II DNA Ligation Kit</td>
			<td>Epicentre Technologies</td>
			<td>LK6201H</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Colorless Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7833</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>CLS136340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>3120-500</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPulser Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noble agar, ultrapure</td>
			<td>Affymetris/USB</td>
			<td>AAJ10907A1</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF, restriction endonuclease</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404052</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>292710</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation broth</td>
			<td>Alpha Biosciences</td>
			<td>P16-115</td>
			<td>Custom made batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 4080</td>
			<td>shake at 200 rpm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim Milk</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0032-17-3</td>
			<td>via Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>or preferred method/vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks, round</td>
			<td>Diamond</td>
			<td></td>
			<td>Any brand of toothpicks, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>45-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anesthesia System Filters</td>
			<td>Perkins and Elmer</td>
			<td>118999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI 8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>Caliper Life Sciences/Xenogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of in-frame gene deletion mutants in pseudomonas aeruginosa and testing for virulence attenuation in a simple mouse model of infection

Mikroorganizmalar genetik olarak çok yönlü ve çeşitlidir ve birçok ticari ürün ve biyofarmasötik kaynağı haline gelmiştir. Bu ürünlerin bazıları doğal olarak organizmalar tarafından üretilse de, diğer ürünler üretim verimini artırmak için organizmanın genetik mühendisliğine ihtiyaç duyarlar. Escherichia coli Avirulent suşları geleneksel biyofarmasötik üretmek için tercih edilen bakteri türleri olmuştur; ancak, bazı ürünlerin E. coli için üretmesi zordur. Böylece, diğer bakteri türlerinin avirulent suşları bazı ticari ürünlerin üretimi için yararlı alternatifler sağlayabilir. Pseudomonas aeruginosa, E. coli'yeuygun bir alternatif sunabilecek yaygın ve iyi çalışılmış bir Gram-negatif bakteridir. Ancak, P. aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Burada, pEX100T-NotI plazmid kullanarak sıralı genomik deletiyonlar yoluyla P. aeruginosa nonpatojenik suşları oluşturmak için kullanılabilecek bir prosedür ayrıntılı. Bu yöntemin en büyük avantajı işaretsiz bir gerinim üretmektir. Bu yöntem, ticari ürünlerin üretimi için yüksek zayıflatılmış P. aeruginosa suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir. Biz de E. coliFDA onaylı BL21 suşu ile karşılaştırıldığında genetiği değiştirilmiş suşu zayıflatma test etmek için doğrulanmış test suşlarının intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bakteriyel sistemik enfeksiyonun basit ve tekrarlanabilir fare modeli açıklar.

Şekil 2'degösterildiği gibi, hedeflenen genomik silme, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR kullanılarak doğrulanabilir. Genomik silme taşıyan koloniler, yabani tip kolonilere kıyasla daha kısa bir PCR bant boyutu sağlayacaktır. 10-12 koloniden oluşan bir PCR ekranı genellikle hedeflenen silme yitirmesini taşıyan en az bir koloniyi tespit etmek için yeterlidir. Birden fazla ekran turundan sonra silme işlemi algılanmazsa,...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection at JoVE.com

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Bu protokol Pseudomonas aeruginosa genomunda zihin-beden istenilen mutasyonların oluşturulması ve belirlenmesi için önemlidir, yanı sıra tekrarlanabilir bir fare modelinde virülans azaltma mutasyonların etkisini test. Bu tekniğin en önemli avantajı krom doğrulama ve fare enfeksiyonu modelinin tekrarlanabilirliğidir. Bakteriler sürekli çalışıyor, sürekli değişiyor.Bu işlemi yavaşlatmak için, dondurulmuş bir durak kullanıyoruz, onları paketliyoruz, fare modelinde test etmeden önce modifikasyonda birden fazla basamak üzerine asıyoruz. Bu yöntemlere aşina olmayan biri büyük olasılıkla geliştirme ve olası crossover rekombinant seçimi ile test etmek için mücadele edecektir. Ayrıca, enfeksiyon için farelerin kullanımı hayvan çalışmaları yabancı biri için zor olacaktır.Bu yöntem diğer patojenlerin ve mutantlarının test edilmesinde ve farelerde virülans bulaşmasıiçin uygulanabilir. Mevcut modeller ile karşılaştırıldığında, tekrarlanabilirlik artı enfeksiyon öncesi ve sonrası klon doğrulama ile prosedürler alanında diğer araştırmacılar yararlanabilir. Bu protokolün görsel gösterimi, tek başına okuma yoluyla anlaşılması veya anlaşılması zor olabilecek kapsamlı prosedürlere içgörü sağlar.Pseudomonas Isolation Broth veya PIB tek crossover, rekombinant koloniler büyüyerek başlayın. Aşılamak ve her kültürün 10 mikrolitre önceden ısıtılmış PIA plakaları üzerine, 10% sakaroz ile takviye. Sonra tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, kuvözden plakaları çıkarın ve büyüme için onları kontrol edin. Sakarozdirençli koloni çift crossover rekombinantlar olmalıdır. Pia önceden ısıtılmış plakalar üzerine en az 20 kolonileri yama steril kürdan kullanın, PIA ile takviye 10%sakaroz, ve PIA carbenicillin ile desteklenmektedir.Bir gecede plakaları kuluçkaya yatırın ve ertesi gün büyüme için inceleyin. Gerçek çift crossover rekombinantlar karbenicillin duyarlı ve sakaroz dirençli olacaktır. Kolonya PCR kullanarak silme için 10 ila 20 koloniyi ekran.Steril bir kürdan ile şüpheli bir çift crossover rekombinant büyüme pick up ve PBS 50 mikrolitre askıya. Süspansiyonu 100 derecede 10 dakika kaynatın. 13,000 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve buza yerleştirin.Daha sonra, el yazması talimatlara göre PCR gerçekleştirin. PCR tamamlandıktan sonra, ürünler üzerinde Agarose jel elektroforez gerçekleştirin. Daha küçük amplifikasyon ürünleri, ilgi alanının silindiği kolonileri gösterir.Enjeksiyonsabahı, bakteri hücrelerinin cryovials dört santigrat üç ila dört saat boyunca çözülür. Şişeleri erittikten sonra buzda tutun ve farelere iki saat içinde enjekte edin. Her cryovial içeriğini yeni bir iki mililitrelik tüp ve santrifüj için 4, 500 kez G 10 dakika aktarın.Supernatant atın ve pbs bir mililitre hücre pelet yeniden askıya. Santrifüjü tekrarlayın ve PBS'deki hücreleri mililitrede 9 koloni oluşturan ünitelere 2,5 kat 10'luk son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın. Konsantrasyonu, genotipi ve fenotipi doğrulamak için her suş son süspansiyon üç örnek alın.Her zorlanma için, iki mililitrelik bir tüp içine hücre süspansiyon 1.5 mililitre aliquot ve kontrol enjeksiyonları için PBS hazırlamak. Steril bir hayvan cerrahi odasında enjeksiyonlar için gerekli fare ve malzemeleri toplayın ve başlamadan önce dezenfekte mendil ile tüm yüzeyleri silin. Isırılırsa delinme riskini sınırlamak için iki çift lateks eldiven, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve yüz maskesi giyin.Fareyi kafesten çıkarın ve tartının, kuyruk işaretini enjeksiyon sonrası izleme için kalıcı marker ile işaretleyin. 27 gauge iğne ile yeni bir mililitreşşü açın ve 200 mikrolitre steril PBS çekin. Başparmağı ve işaret parmağını kullanarak fareyi kulaklarının arkasından yakalayın ve ensede bir deri kıvrımı oluşturmak için çimdiklayın.Daha sonra, fare düz ve hareketsiz tutmak için serçe parmağı kullanarak avuç içine kuyruk güvenli. İğneyi 30 derecelik bir açıyla orta hattın solundaki veya sağına periton boşluğuna yerleştirin. Organlara takılmadığından emin olmak için iğneyi hafifçe kaldırın.Sonra, yavaş yavaş PBS enjekte ve iğne çekin. Enjeksiyon yerinde bir bolus tipiktir. İğneyi belirlenen keskinlik leri imha kabına yerleştirin ve fareyi ayrı bir kafese taşıyın.Bir sonraki fare ile prosedürü tekrarlayın ve bir kafesteki tüm fareler enjekte edildikten sonra, onları orijinal kafesine geri taşıyın. Kontrol grubuna enjekte ettikten sonra, aynı prosedürü kullanarak test gruplarına enjekte edin. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, fareleri barınma odasına geri getirin ve çalışma alanını dezenfekte mendillerle temizleyin.Hayvanları görüntülemek için, kamera parametrelerini ayarlayarak ve sahneyi ısıtarak görüntüleme sistemini hazırlayın. Oksijen akışını dakikada 1,5 litreye ve izofluranı %3,5'e ayarlayın ve fareyi anesteziden sonra sabitlenen sıcaklık aşamasına, anestezi odasına taşıyın. Fareyi kollarını uzatarak sırtına yerleştirin ve görüntüleme sırasında %2,5 izofluran uygulanması için bir burun konisi sığdırın.Kapıyı kapatın ve farenin biyolüminesans görüntülerini ve röntgenlerini alın. Görüntüleme tamamlandığında fareyi kafesine geri döndürün ve izleyin. 3-5 dakika içinde kendine gelecek.Hedeflenen genomik silmeler, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR tarafından doğrulandı. Genomik silme ile koloniler yabani tip kolonilere göre daha kısa bir PCR bandı verim. P aeruginosa zayıflatılmış suşu intraperitoneal enjeksiyon, PGN beş, 0% mortalite ile sonuçlandı, E.coli BL ile gözlenen mortaliteye eşdeğer 21.Ancak ebeveyn türünün enjeksiyonu farelerin %80'ine göre ölümcüldü. Enfeksiyon progresyonu biyolüminesans işaretli ebeveyn ve zayıflatılmış suşlar kullanılarak izlendi. Zayıflatılmış suşu, biyolüminesans solana kadar enjeksiyon yerinde lokalize olarak kaldı, ki bu da büyük olasılıkla enfeksiyonun temizlenmesiyle çakıştı.Sunulan yöntem sadece suş tarafından üretilen mortalite incelenmiştir. Daha derinlemesine immünolojik ve toksikolojik yönleri enfeksiyon dinamikleri ve enfeksiyon ölümle sonuçlanmaz son etkisi belirlemek için kullanılabilir. Prosedürdeki en önemli şey, ilk tanımlamadan hayvan testlerine kadar çeşitli adımlar arasında yapılan kapsamlı doğrulamadır.Test edilen suşlar mutasyon alabildiği veya kontamine olabileceğinden, belirli doğrulama adımlarının eksik olması potansiyel olarak yanlış sonuca yol açabilir. Bu iki tekniğin geliştirilmesi ile, bu enfeksiyon immünoloji alanında araştırmacılarımızın daha etkili nasıl güçlü paket etkileşimaşırı fenotip, sepsis ve mortalite yol açtığını araştırmak için izin olacağını düşünüyorum. Farklı besinlerin varyantlar üzerindeki etkisi bakterilerin boyut dosing ilerleyerek karşılaştırılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...