Name: cochlear surface preparation in the adult mouse
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00
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설명된 연구 프로젝트는 청각 장애 및 기타 통신 장애에 대한 국립 연구소, 건강의 국립 연구소에서 보조금 R01 DC009222에 의해 지원되었다. 이 작업은 보조금 C06 RR014516에 의해 지원 되는 개조 된 공간에서 MUSC의 WR 건물에서 수행되었다. 동물은 국립 연구 자원 센터의 교외 연구 시설 프로그램에서 보조금 C06 RR015455에 의해 지원 MUSC CRI 동물 시설에 보관되었다. 저자는 그의 귀중한 의견에 대한 박사 요헨 샤흐트 감사와 원고의 교정 안드라 탈라스카.

10-12주 및 6-8주 연령대의 C57BL/6J 마우스의 연령대에 남성 성인 CBA/J 마우스와 관련된 모든 연구 프로토콜은 사우스캐롤라이나 의과 대학(MUSC)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다. 동물 관리는 MUSC에서 실험실 동물 자원의 부서의 감독하에 있었다.
참고: 아래에 제시된 절차의 경우, 마우스는 피하 주사를 통해 케타민 (100 mg/kg)과 자일라진 ...

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	<li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA/J+mouse.">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li><li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guide+to+plotting+a+cochleogram.">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li><li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss.">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li><li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+insult+to+injury:+cochlear+nerve+degeneration+after+"temporary"+noise-induced+hearing+loss.">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li><li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. 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W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection.">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).</li><li>. MassEyeAndEar.org Available from: <a target="_blank" href="https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories">https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories</a> (2019)</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea.">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li><li>. Corning Cell Culture Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf</a> (2019)</li><li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. 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R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing.">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li><li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death.">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1262 (2014).</li><li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea.">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).</li></ol>

면역 라벨링과 함께 전체 마운트 표면 제제의 달팽이관 미세 해부는 내이 병리 및 분자 메커니즘을 조사하는 기본 도구를 제공합니다. 이러한 변형된 성체 마우스 달팽이관 해부 방법은 세포 및 조직 접착제를 사용하여 이러한 어려운 절차를 단순화한다.
이 수정된 달팽이관 표면 준비 방법은 비교적 쉽고 접근하기 쉽지만 숙련도를 달성하기 위해서는 여전히 연습이 필요합?...

달팽이관은 소리 감지에 전념하고 청력을 담당합니다. 달팽이관 덕트뼈 미로에 나선형 모양으로 코일 및 청각 감각 끝 기관, 코르티의 기관을 보유 (OC). OC는 달팽이관 막에 달려, 성인 CBA/CaJ 마우스에서 풀어 때 대략 5.7 mm의 길이를 가진 달팽이관 상피를구성합니다 1,2. OC는 정점의 베이스에서 검출된 고주파와 낮은 주파수로 비공식적으로 구성되기 때문에, 달팽이관 상피는 종종 분석 비교를 위해 세 부분으로 나뉩니다: 낮은 에 상응하는 정점, 중간 및 기저 회전, 각각 고주파 검출을 할 수 있습니다. 지지 세포의 배열 이외에, OC는 달팽이관 나선형에 대하여 측면으로 위치한 내측 및 외부 모발 세포 (OHCs)의 3 행에 위치한 내부 모발 세포 (IHCs)의 한 행으로 구성된다.
올바른 청각 처리는 달팽이관의 감각 모발 세포의 무결성에 달려 있습니다. 감각 모발 세포의 손상 또는 손실은 과도한 소음에 노출, 이독성 약물의 사용, 세균 또는 바이러스 성 귀 감염, 머리 부상 및 노화와 같은 수많은 병인으로 인한 후천성 청력 손실의 일반적인 병리학 적 특징입니다. 프로세스3. 또한, 내부 모발 세포 / 청각 신경 시냅스의 무결성과 기능은 가벼운 모욕에 의해 손상 될 수있다4. 분자 및 유전 정보의 가용성과 녹아웃 및 노크 인 기술에 의한 유전자 조작으로 마우스는 청력 과학에서 널리 사용되어 왔습니다. 성인 마우스 달팽이관은 소문자이고 달팽이관 상피는 기술적으로 어려운 미세 내부, 면역 표지 또는 면역 조직 화학과 조합하여 상피의 표면 제제의 결과로 뼈 캡슐에 둘러싸여 있지만 및 공초점 이미지는 광범위하게 달팽이관 병리의 조사를 위해 사용되었습니다, 리본 시냅스와 모발 세포의 손실을 포함, 감각 모발 세포와 지원 세포에서 단백질의 수준의 변화, 및 모발 세포 재생. 달팽이관 표면 제제는 또한 리포터 유전자(즉, GFP)의 발현 패턴을 결정하고 성공적인 트랜스덕션을 확인하고 형질전환 세포 유형을 식별하는 데 사용되어 왔다. 이러한 기술은 이전에 성인 CBA/J 마우스5,6,7,8,9를사용하여 소음 유발 난청을 기초로 하는 분자 메커니즘의 연구에 사용되어 왔다.
파라핀 절편이나 극저온절을 이용한 면역조직화학과는 달리 각 섹션에 3개의 외부 모발 세포(OHCs)와 1개의 내부 모발 세포(IHC)를 포함하는 달팽이관의 작은 단면 부분을 얻을 수 있으며, 달팽이관 표면 제제는 특정 기능적 주파수에 대응하는 감각 모발 세포 및 리본 시냅스와 면역 라벨링을 계수하기 위한 OC의 전체 길이를 시각화합니다. 표 1은 뮬러1과 비버그 및 캔론1,2의연구에 따른 성인 CBA/J 마우스에서 달팽이관 나선형의 길이를 따라 거리 의 함수로서 청각 주파수의 매핑을 나타낸다. 달팽이관 표면 제제는 달팽이관 병리의 조사를 위해 널리 이용되었습니다4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. 전체 마운트 달팽이관 해부 방법은 원래 1966년 16에서 한스 엥스트롬에 의해 편집 된 책에 설명되었다. 이 기술은 이후 과학10,11,12,13,청각 과학의 다수의 과학자들에 의해 문헌에 기술된 바와 같이 다양한 종에 정제및 적응되었다. 15,17 및 매사추세츠 눈과 귀18에서이튼 - 피바디 연구소에 의해 . 최근, 또 다른 달팽이관 해부 방법은 몽고메리 외19에의해 보고되었다 . 달팽이관의 미세 해부는 달팽이관 표면 준비를 위한 필수적이고 중요한 단계입니다. 그러나 마우스 달팽이관 해부는 기술적인 과제이며 상당한 연습이 필요합니다. 여기서, 변형된 달팽이관 표면 제제 방법은 성인 마우스 달팽이관에서 사용하기 위해 제시된다. 이 방법은 면역 라벨링을 위해 10 mm 라운드 커버슬립에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위해 세포 및 조직 접착제 (즉, Cell-Tak)의 decalcification 및 사용을 요구합니다. 세포 및 조직 접착제는면역조직화학(20)에널리 사용되고 있다. 이러한 수정된 달팽이관 미세해부 방법은 이전에 보고된18,19에비해 비교적 간단하다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-mm Rund Coverslips</td>
			<td>Microscopy products for science and industry</td>
			<td>260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboard Micro Slide Trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST fine science tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-gel with Tris Buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-well Cell Culture Dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-myosin VIIa Antibody</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25-6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CtBP2 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Glu2R Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100491-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cochlear surface preparation in the adult mouse

달팽이관의 청각 처리는 메카노 감각 모발 세포의 무결성에 달려 있습니다. 일생 동안, 청력 손실은 과도한 소음에 노출, 이독성 약물의 사용, 세균 또는 바이러스 성 귀 감염, 머리 부상 및 노화 과정과 같은 수많은 병인에서 취득 될 수있다. 감각 모발 세포의 손실은 획득 한 청력 손실의 품종의 일반적인 병리학 적 특징입니다. 또한, 내부 모발 세포 시 냅 스 가벼운 모욕에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서, 달팽이관 상피의 표면 제제는, 면역 표지 기술 및 공초점 이미지와 함께, 리본 시냅스와 감각 모발 세포의 손실을 포함하여 달팽이관 병리의 조사에 매우 유용한 도구입니다, 모발 세포의 단백질 수준 변화 및 지원 세포, 모발 세포 재생 및 보고서 유전자 발현 (즉, GFP)의 결정은 성공적인 트랜스덕션의 검증 및 형질전환 세포 유형의 식별을 위한 것입니다. 달팽이관, 내이에 뼈 나선형 모양의 구조, 청각 감각 말단 기관, 코르티의 기관을 보유 (OC). OC에 있는 감각 머리 세포 및 주변 지지 세포는 달팽이관 덕트에 포함되고 바실라 막에 휴식, 정점에 있는 기지 및 저주파에서 일어나는 고주파 검출을 가진 tonotopic 방식으로 조직됩니다. 분자 및 유전 정보의 가용성과 녹아웃 및 노크 인 기술에 의해 유전자를 조작 할 수있는 능력으로, 마우스는 청각 과학을 포함한 생물학적 연구에 널리 사용되어왔다. 그러나, 성숙한 마우스 달팽이관은 아주 작기 이고, 달팽이관 상피는 뼈 미로에서 캡슐화되고, microdissection을 어렵게 만듭니다. 많은 실험실에서 해부 기술이 개발되고 사용되었지만, 세포 및 조직 접착제를 사용하는 이 변형된 미세 해부 방법은 더 쉽고 편리합니다. 그것은 decalcification 다음 성인 마우스 달팽이관의 모든 유형에 사용할 수 있습니다.

달팽이관 상피의 표면 제제는, 면역 표지 및 공초점 화상 진찰과 결합하여, 리본 시냅스의 정량화, 감각 모발 세포의 정량화와 같은 달팽이관 병리의 조사를 위해 청각 과학에서 광범위하게 사용되었습니다, 감각 모발 세포에서 단백질 발현5,6,7,8. 표면 준비를 위한 성인 마우스 달팽이관의 해부는 간?...

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Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

달팽이관 표면 제제는 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 사용하여 코르티 장기의 전체 렌즈를 시각화 할 수 있습니다. 그것은 광범위하게 관심의 특정 달팽이관 병리학의 조사에 사용되었습니다. 우리는 달팽이관 미세 절법을 수정합니다.이 기술의 주요 장점은 여러 세척 단계 동안 조직 손실을 피하면서 면역 라벨링 절차를 위해 10mm 라운드 커버립으로 달팽이관 상피 조각을 준수하는 것입니다. 또한 달팽이관 병리학, 달팽이관 표면 제제는 또한 평가 발현 및 모발 세포 재생을 위해 활용될 수 있다. 이 기술에 기본적인 현미경 기술이 필요하며 방법의 시각적 데모는 각 단계가 올바르게 수행되도록 하는 데 도움이 될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 Qiaojun Fang이 될 것입니다. 측두골 추출의 경우 즉시 모템 후 피부를 앞쪽으로 당겨 두개골 뼈를 노출시키고 가위를 사용하여 두개골의 중앙 선을 따라 후방 측면에서 뼈를 자른다. 엄지 손가락과 검지 손가락을 사용하기 전에 뇌 조직을 제거하기 위해 집게를 사용하여 3 개월 이상의 마우스에서 측두골을 수동으로 제거하십시오.뼈를 30mm 직경의 페트리 접시에 넣고 신선한 얼음 차가운 4% PFA및 PBS를 해부 현미경아래에 넣고 타원형 창에서 스테이프를 제거합니다. 5번 집게로 둥근 창막을 뚫고, 달팽이관 정점에 작은 구멍을 만들기 위해 신선한 4%PFA가 들어있는 1밀리리터 주사기에 부착된 27게이지 바늘을 사용합니다. 용액이 정점의 작은 구멍에서 세차질 될 때까지 둥근 창문과 타원형 창을 통해 고정 용액으로 코클레아를 부드럽고 천천히 견딜 수 있습니다.그런 다음 최대 2개의 응고된 달팽이관을 유리병 당 4%PFA의 10밀리리터를 포함하는 개별 20 밀리리터 신경병 바이알로 옮기고 실온에서 2시간 동안 샘플을 부드럽게 교반하고 회전자에 섭씨 4도에서 하룻밤 을 보관합니다. 다음 날 아침, 코클레아를 세척당 신선한 PBS로 5분간 씻는다. 마지막 세척 후, 각 유리병에 4 %EDTA의 20 밀리리터를 추가하고 부드러운 동요와 섭씨 48 시간 동안 샘플을 회전.인큐베이션의 끝에서, 샘플의 탄력성을 평가하기 위해 집게로 각 달팽이관의 뼈 전정 부분을 터치합니다. 뼈가 단단하지 않고 탄력있는 경우, 달팽이관은 탈질화되었습니다. 각 샘플에 대해 EDTA를 신선한 PBS로 교체합니다.달팽이관 상피의 미세 절부의 경우, 측두골의 정전 부분을 집게로 잡고 메스를 사용하여 45도 각도로 정골 회전을 자른다. 둥근 창과 타원형 창 사이의 희미한 선을 따라 수직으로 잘라 달팽이를 전정 부분에서 분리하고 바질 회전으로 달팽이관 부분을 방향을 조정하여 페트리 접시의 상단을 향해 돌립니다. 이 위치에서, 중간 회전의 뼈 캡슐과 측면 벽을 파기하여 정단면이 제거된 끝으로 절단하고 중간 부분을 기초 및 후크 영역으로부터 완전히 분리하기 위해 절단을 계속한다.바실라 멤브레인 부위를 접시의 바닥을 중심으로 바실라 멤브레인 부위를 배치하고, 후크 영역의 내측을 수직으로 잘라 내측을 제거하고 바질 및 후크 영역을 잘라 후크 부분을 분리합니다. 조직의 왜곡을 피하기 위해, 기저 회전 및 후크 영역의 분리 전에 후크 영역의 내측을 잘라. 뼈 캡슐과 중간 회전의 측면 벽 조직의 상대적으로 큰 부분을 잘라 페트리 접시의 바닥과 뼈 캡슐과 측면 벽을 정렬하는 집게와 측면 벽을 잡고, 바질라 막 측에서이러한 조직을 잘라.다음으로, 표본을 평평하게 하여 감각적인 모발 세포 표면면을 위로 향하게 하고 뼈 캡슐과 측면 벽의 나머지 부분을 다듬습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 지각 막을 제거하여 중간 부위를 완전히 분리하고 뼈 캡슐, 측면 벽 조직 및 남은 회전의 지각 영역을 방금 입증한 것처럼 제거합니다. 모든 달팽이관 회전이 해부되면, 세포 및 조직 접착제의 0.5 마이크로 리터를 1 라운드 10 mm 커버 슬립의 중앙에 확산하고 실온에서 3 ~ 5 분 동안 접착제가 건조 할 수 있습니다.말린 커버립을 페트리 접시에 넣고 각 감각 상피 샘플 4개를 모두 하나의 커버슬립에 붙입니다. 그런 다음 집게를 사용하여 각 커버슬립의 한 가장자리를 파악하여 면역학 라벨링을 위한 4웰 세포 배양 접시의 개별 우물로 표본을 옮기는 다. 표면 달팽이관 시냅스 제제의 면역 라벨링을 위해, 각 감각 상피를 세척당 신선한 PBS로 5분 동안 3회 세척한 다음, 각 시료의 처리에 따라 회전기의 실온에서 30분 동안 2밀리리터2밀리리터를 처리합니다.인큐베이션의 끝에서, 각 우물에서 계면 활성제 용액을 흡습하고 실온에서 부드러운 교반과 회전기에 1 시간 동안 잘 차단 솔루션의 100 마이크로 리터와 비특이적 결합을 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도에서 24시간 동안 관심있는 1차 항체의 100 마이크로리터로 각 상피를 표시하기 전에 부드러운 동요 하에서 입증된 바와 같이 PBS로 샘플을 세 번 세척한다. 다음 날, 신선한 PBS와 세척당 부드러운 동요로 샘플을 세 번 세척하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도에서 2시간 동안 관심있는 적절한 이차 항체의 100 마이크로리터로 표본을 라벨을 붙입니다.인큐베이션이 끝나면 시료를 시료가 올려 놓는 개별 유리 현미경 슬라이드에 각 커버슬립을 놓기 전에 세척당 신선한 PBS에 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척합니다. 다음으로 각 커버슬립의 중앙에 적절한 장착 매체8마이크로리터를 조심스럽게 추가하고 집게를 사용하여 각 샘플에 10mm 커버슬립을 더 장착합니다. 그런 다음 각 커버슬립 샌드위치의 측면을 명확한 매니큐어로 밀봉하고 샘플을 골판지 슬라이드 폴더에 넣고 슬라이드를 섭씨 4도에 보관합니다.표면 준비를 위한 성인 마우스 달팽이관의 해부는 간단하지 않지만, 기술에 새로운 연구원은 10 에서 15 귀로 연습 한 후 방법을 배울 수 있어야합니다. CTBP2 및 GluA2를 가진 치료되지 않은 10-12주 된 CBAJ 마우스의 표면 제제의 면역 라벨링은 전시냅스 리본과 포스트냅스 말기 둘 다 각각 내부 모발 세포 핵 아래에 위치하고 기능성 시냅스를 나타내는 병치된다는 것을 보여줍니다. 미오신 7A에 대한 면역 라벨링 및 phalloidin 및 DAPI를 포함하는 카운터스테인링은 외부 모발 세포 및 내부 모발 세포 및 핵을 포함한 감각 모발 세포의 존재를 드러낸다.미신 7A및 phalloidin을 사용한 반염색에 대한 면역 라벨링은 세포 및 조직 접착제의 사용 여부에 관계없이 면역 반응성 또는 균일성에 차이가 없음을 나타낸다. 또한, 6~8주 된 C57 블랙 6 마우스로부터 표면 제제의 전자 현미경 검사를 스캐닝하여 시료의 3열에서 외부 모발 세포의 잘 조직된 V자 형 스테레오시리아를 시연한다. 용액이 정점에 있는 작은 구멍에서 흘러 나올 때까지 둥근 창문과 타원형 창을 통해 고착용용으로 달팽이관을 천천히 채우는 것을 기억하십시오.후크 영역을 기초 회전에서 분리하기 전에 후크 영역의 내측을 잘라 내측의 제거를 용이하게하십시오.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

연구

신경과학

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

전체 마운트 해부 및 성인 마우스 달팽이관의 면역 형광

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...