Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح P50 CA174521 (إلى J.R. هاو و ص Bellizzi). عدسه P.H. الاذن هو المتلقي لجائزه برنامج تعزيز الحياة المهنية P50 CA174521.

وقد تمت الموافقة علي جميع التجارب باستخدام عينات الورم العصبي الغدد الصماء البشرية من قبل جامعه أيوا مستشفي وعيادات اللجنة الهجرة والامومه (البروتوكول رقم 199911057). وترد قائمه بجميع المواد والمعدات في جدول المواد. وترد في الجدول 1قائمه بوسائط النمو والحلول الرئيسية.
<p cla...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

أصبحت الثقافات الورم 3D موردا قيما لاختبار المخدرات قبل السريرية15. وقد أنشئت في الاونه الاخيره الأورام العضوية المختلفة بيوانكات من سرطان الثدي وأورام سرطان البروستاتا16,17. في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا للثقافة SBNET كما خزان وطريقه ?...

الأورام العصبية المعوية الصغيرة (سبنتس) تنشا من خلايا enterochromaffinه من الأمعاء الصغيرة. علي الرغم من انه من المعروف عموما SBNETs تنمو ببطء, انها تنتشر عاده إلى الكبد1. في حين يمكن النظر في أزاله الجراحية أو استئصال الورم في كثير من الحالات ، وتكرار يكاد يكون عالميا ، التالي ، العلاج الطبي يلعب دورا هاما في الاداره. وقد استثمرت جهود هائله لتوليد خطوط خلوية جديده SBNET لاختبار المخدرات. ومع ذلك ، لم يكن هناك نجاح يذكر. فقط 6 خطوط الخلايا sbnet (krj-I, CND2, GOT1, ف-sts, L-sts, H-sts) وقد تم الإبلاغ عن2,3,4,5; وللاسف خط خليه واحده لم يعد يعبر عن علامات NET6 وثلاثه أخرى خطوط الخلية sbnet (krj-I ، L-Sts ، H-sts) كانت مصممه علي ان تستمد من الليمفاوية تحولت بدلا من الشباك7. وللتعجيل بتحديد الادويه اللازمة لاستهداف الشبكات الكهربائية الخاصة ، هناك حاجه إلى أساليب بديله لاختبار المخدرات في المختبر.
هنا ، ونحن نستفيد من توافر SBNETsات وانشات وسيله للثقافة هذه SBNETs المستمدة من المريض كما خزان النمو في ECM. الهدف العام لهذه المخطوطة هو وصف طريقه للثقافة SBNET كثقافة ثلاثية الابعاد (3D) والخطوط العريضة الإجراءات لتوصيف هذه الخزان للاحتفاظ بعلامات SBNET عن طريق تلطيخ المناعي والمناعي.
الاضافه إلى ذلك ، فاننا نظهر كيف يمكن استخدام هذه SBNET خزان لاختبار تاثير rapamycin ، وهو دواء مضاد للسرطان لشبكات8. الأساس المنطقي وراء هذا البروتوكول هو تطوير طريقه جديده لزراعه خلايا SBNET في المختبر واستخدامها لاختبار المخدرات. الميزة من هذا تقنيه علي الطريقة تقليديه من يؤسس [سبنت] خليه خط ان ثقافات [3 د] من [سبنتس] يستطيع بسرعة كنت نلت واختبار المخدر يستطيع كنت أنجزت ضمن 3 أسابيع. ويمكن استخدام SBNET خزان كنموذج لأداء في شاشات المخدرات في المختبر لتحديد الادويه الجديدة للمرضي SBNET. منذ خطوط الخلايا SBNET ليست متاحه علي نطاق واسع ، والثقافات 3D من خزان SBNET يمكن ان تكون بمثابه نموذج جديد في المختبر لدراسة Sbnetات ويمكن تقاسمها بين العلماء في هذا المجال.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

أورام الغدد الصماء العصبية الصغيرة (SBNETsات) هي سرطانات نادره منشؤها خلايا enterochromaffinه من الأمعاء. وقد كان البحث في هذا المجال محدودا لأنه تم إنشاء عدد قليل جدا من خطوط الخلايا SBNET المستمدة من المريض. خلايا SBNET المتمايزة بشكل جيد بطيئه النمو ويصعب نشرها. والخطوط الخلوية القليلة التي أنشئت ليست متاحه بسهوله ، وبعد وقت في الثقافة قد لا تستمر في التعبير عن خصائص الخلايا NET. توليد خطوط الخلايا الجديدة قد يستغرق سنوات عديده منذ الخلايا SBNET لديها وقت مضاعفه طويلة وهناك حاجه إلى العديد من الخطوات الإثراء من أجل القضاء علي الأورام الليفية المرتبطة بالسرطان بسرعة الانقسام. للتغلب علي هذه القيود ، قمنا بتطوير بروتوكول للثقافة SBNET الخلايا من الأورام المزالة جراحيا كما خزان في مصفوفة خارج الخلية (ECM). يشكل ECM مصفوفة ثلاثية الابعاد تغلف خلايا SBNET وتحاكي البيئة الصغرى للورم للسماح لخلايا SBNET بالنمو. هنا ، ونحن ميزت معدل النمو من SBNET خزان ووصفت طرق لتحديد علامات SBNET باستخدام المجهر المناعي ومناعي للتاكد من ان الخزان هي خلايا الورم الغدد الصماء العصبية. الاضافه إلى ذلك ، استخدمنا SBNET خزان لاختبار السمية الخلوية من rapamycin.

هناك حاليا فقط 2 خطوط الخلية sbnet التي أنشئت ونشرت2,3,4,5 وانها ليست متاحه بسهوله لكثير من الباحثين. هنا, نقترح علي الثقافة SBNET كما خزان في ECM واستخدام هذا كنموذج بديل لدراسة الحساسية SBNET المخدرات. تم جمع الورم المشتق من المري?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

أورام الغدد الصماء العصبية (الناموسيات) تنشا من خلايا الغدد الصماء العصبية. فهي بطيئه النمو وتحديا للثقافة. نحن نقدم استراتيجية بديله لزراعه الشباك من الأمعاء الصغيرة عن طريق الخياطة لهم كما خزان. هذه الخزان لديها علامات الأمعاء الصغيرة NET ويمكن استخدامها لاختبار المخدرات.

إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

خلايا SBNET المتمايزة بشكل جيد بطيئة النمو ويصعب نشرها. خطوط الخلية القليلة المنشأة ليست متاحة بسهولة للباحثين. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير هذا البروتوكول ثقافة 3D.وميزة هذه التقنية على الطريقة التقليدية لإنشاء خط الخلية SBNET هو أنه يمكن الحصول على الثقافات 3D واختبار المخدرات يمكن القيام به في غضون ثلاثة أسابيع. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أورام الغدد الصماء العصبية الأخرى مثل أورام الغدد الصماء العصبية من البنكرياس. بعد الحصول على عينة SBNET المريضة التي تم استئصالها، قم بقطعها إلى مكعبات خمسة ملليمترات وتخزينها في 25 ملليلتر من متوسط DMEM F12 في أنبوب مخروطي للنقل.احتضان الأورام في غسل المتوسطة أعدت وفقا لتوجيهات المخطوطات لمدة 15 دقيقة. ثم نقلها إلى طبق جديد و mince لهم إلى أقل من قطعة ملليمتر واحد باستخدام مقص منحنى معقمة. نقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر يحتوي على 25 ملليلتر من غسل المتوسطة، ثم الطرد المركزي العينة في 500 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.تجاهل السوبر و resuspend الكريات في 10 ملليلتر من غسل المتوسطة مع الكولاجيناز وDNase. السماح للأورام المفرومة لهضم في 37 درجة مئوية مع اهتزاز بطيء لمدة 90 دقيقة. من المهم عدم هضم عينات الورم.الكثير من الانزيم أو فترة حضانة أطول سوف تقتل الخلايا SBNET. بعد اكتمال الهضم، الطرد المركزي الأنبوب في 500 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل افراط و resuspend بيليه في 15 ملليلتر من غسل المتوسطة.ضع مصفاة 70 ميكرومتر على رأس أنبوب جديد 50 ملليلتر ونقل 10 ملليلتر من عازلة الغسيل من خلال المصفاة. دوامة العازلة غسل داخل أنبوب لمنع الخلايا من التمسك الجانبين. ثم تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة.أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant و resuspend بيليه في 200 ميكرولترات من غسل المتوسطة. ضع الأنبوب على الجليد واستخدم خمسة ميكرولترات من الخلايا لعد الخلايا مع مقياس الدم.حساب عدد الخلايا، ثم كرر الطرد المركزي لإزالة عظمى وإعادة تعليق الخلايا في ECM السائل بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك، نقل خمسة إلى 20 ميكرولترات من spheroids SBNET في ECM إلى لوحة 96 جيدا ووضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح ECM السائل لترسيخ. إضافة 200 ميكرولتررس من SBNET ثقافة المتوسطة لكل بئر تحتوي على spheroids أو ثقافة organoids في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية كما هو موضح سابقا.استخدام ماصة P1000 لنقل organoids إلى أنبوب 1.5 ملليلتر والطرد المركزي الأنبوب في 1، 500 مرات ز لمدة دقيقة واحدة لإزالة عظمى. غسل الثقافة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي مرة أخرى لإزالة فائقة. ثم إصلاح organoids بإضافة 500 ميكرولترات من شبه شكلي واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة.بعد الحضانة، وغسل الثقافة مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مع 3 ٪ BSA و 0.1 ٪ تريتون X - 100 ل Permeabilize الثقافة. احتضان الأنبوب لمدة خمس دقائق ، ثم غسل organoids ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني و 3 ٪ BSA.بعد ذلك ، احتضان الثقافة مع الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة ثم كرر يغسل مع برنامج تلفزيوني وBSA. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية وتكرار يغسل التأكد من التعرق والتخلص من جميع supernatant. لتصوير spheroids، إضافة خمسة microliters من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI واستخدام ماصة P20 لنقل خمسة ميكرولترات من spheroids إلى شريحة زجاجية.ختم الشريحة مع غطاء وصورة مع المجهر المفلور باستخدام أهداف 10 و 20 و 40X. ميكانيكيا كسر ECM مع ماصة P1000 ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر معقمة. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1،000 مرات ز في أربع درجات مئوية.ثم إزالة جميع ناظر ووضع الأنبوب على الجليد. إضافة مرتين إلى أربعة أضعاف حجم ECM جديدة إلى بيليه وخلط محتويات أنبوب عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات مع التأكد من تجنب إدخال فقاعات الهواء. نقل خمسة إلى 20 ميكرولترات من ECM و SBNET خليط إلى لوحة جديدة 96 جيدا والسماح ECM لترسيخ.ثم تغطية ECM الصلبة مع SBNET المتوسطة الجديدة ووضع لوحة في الحاضنة. إذا كان الشحن SBNET spheroids إلى معمل آخر، نقل spheroids مع ECM الجديدة إلى قارورة T25 والسماح ECM إلى ترسيخ. ملء القارورة مع SBNET الوسيلة spheroid، المسمار الغطاء على بإحكام، وإعداد حزمة الشحن.عند تلقي ثقافة spheroid إزالة الوسيطة الثقافة وكرر الخطوات السابقة لوضع spheroids مرة أخرى في الثقافة. تم رصد معدل النمو spheroid SBNET مع التصوير المجهري. يستغرق حوالي 14 يوماً لsBNET spheroids إلى مضاعفة في الحجم عند تغيير وسائط الثقافة مرة واحدة في الأسبوع.بعد 14 يوما في الثقافة، لا تزيد spheroids SBNET في الحجم. كانت الـ spheroids ملطخة بأجساد مضادة محددة ضد synaptophysin وchromogranin A وSSTR2 وصورت باستخدام المجهر المناعي. وأظهرت البيانات أن هذه العلامات مترجمة في السيتوبلازم وعند غشاء خلايا SBNET.لضمان خصوصية الأجسام المضادة ، تم إجراء نفس إجراءات التلطخ على خط organoid من ورم البنكرياس الذي لا يعبر عن synaptophysin ، chromogranin A و SSTR2 ولم يتم الكشف عن أي إشارة خضراء. الميزة الرئيسية للتصوير المناعي للفلوروس هو أنه يمكن القيام به في غضون أربع ساعات وإعطاء معلومات تلطخ مماثلة للكيمياء المناعية. زراعة SBNET كما spheroids هو تقنية قيمة لتحديد الأدوية التي يمكن أن تمنع نمو SBNET.تم التعامل مع spheroids مع rapamycin ومثبط MTOR. بعد خمسة أيام، وشكل الروسي المعالج بالراباميسين بنية تشبه العنب وأصبح مُنقبًا أو نخريًا. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن قبل الرطب مصفاة الخلية وأنبوب جمع مع غسل المتوسطة.وهذا سيمنع خلايا SBNET من التمسك مصفاة الخلية والأنابيب البلاستيكية. مع هذا البروتوكول، يمكن للعلماء والأطباء إنشاء SBNET الثقافات spheroid من الأورام التي تم استئصالها، ومشاركتها مع مختبرات أخرى، واستخدامها لاختبار الأدوية وافقت ادارة الاغذية والعقاقير.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

إجراءات عمل لElectrochemotherapy للعلاج من ورم في الكلاب والقطط

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

استخدام الموجات فوق الصوتية تسترشد الأنسجة الموجهة غرس الخلوية لإنشاء تكثيفها الورم المنتشر بيولوجيا ذات الصلة

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

مسح بصري سريع لتحليل شبه عالي الإنتاجية للأورام الكروية

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

تقييم صحة الميتوكوندريا في الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان المعزولة من كرويات ورم الرئة متعدد الخلايا 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...