Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH Grants P50 CA174521 (til J.R. Howe og A.M. Bellizzi). P.H. ear er modtager af P50 CA174521 Career Enhancement program Award.

Alle eksperimenter med humane neuroendokrine tumorprøver er blevet godkendt af University of Iowa Hospital og klinikker IRB-Udvalget (protokolnummer 199911057). En liste over alle materialer og udstyr er beskrevet i tabellen over materialer. En liste overvækst medier og nøgle løsninger findes i tabel 1.
1. tyndtarm neuroendokrine tumor (SBNET) indsamling og celle dissociation
<ol><li>Få resekterede patient sbnet prøver efter tumor væv bekræftelse fra...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Tumor 3D kulturer er blevet en værdifuld ressource for prækliniske dopingtest15. Forskellige tumor organoid biobanker er for nylig blevet etableret fra brystkræft og prostatakræft tumorer16,17. I denne undersøgelse, vi giver en detaljeret protokol til kultur SBNET som sfæroider og en enkel og hurtig metode til at validere de sfæide kulturer for netto markører ved immunofluorescens og teststof følsomhed. Fra vores erfaring kan sbne...

Små tarm Neuroendokrine tumorer (SBNETs) stammer fra enterochromaffin celler i tyndtarmen. Selv om sbnets er generelt kendt for at vokse langsomt, de almindeligvis metastaserer til leveren1. Mens kirurgisk fjernelse eller tumor ablation kan overvejes i mange tilfælde, gentagelse er næsten universel, og, derfor, medicinsk terapi spiller en vigtig rolle i ledelsen. Enorme indsats er blevet investeret for at generere nye SBNET cellelinjer for Drug test. Men der har været meget lidt succes. Kun 6 sbnet cellelinjer (krj-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) er blevet rapporteret2,3,4,5; og desværre en cellelinje ikke længere udtrykker netto markører6 og tre andre sbnet cellelinjer (krj-I, L-STS, H-STS) var fast besluttet på at være afledt af transformerede Lymfoblaster i stedet for NETs7. For at fremskynde identifikationen af lægemidler til målretning af Sbn'er er der behov for alternative metoder til in vitro-lægemiddel testning.
Her udnytter vi tilgængeligheden af generede Sbn'er og har etableret en måde at dyrke disse patient afledte Sbn'er på, da spheroider vokser i ECM. Det overordnede mål med dette manuskript er at beskrive en metode til kultur SBNET som en tredimensionel (3D) kultur og skitse procedurer til at karakterisere disse sfæroider til fastholdelse af SBNET markører ved immunofluorescens farvning og immun histokemi.
Derudover viser vi, hvordan disse sbnet sfæroider kan bruges til at teste effekten af Rapamycin, et anti-cancer-lægemiddel til NETs8. Rationalet bag denne protokol er at udvikle en ny metode til at vokse SBNET celler in vitro og bruge dem til Drug test. Fordelen ved denne teknik over den traditionelle metode til at etablere en SBNET cellelinje er, at 3D-kulturer af SBNETs hurtigt kan opnås og Drug test kan gøres inden for 3 uger. SBNET sfæroider kunne potentielt anvendes som model for udførelse af in vitro-lægemiddel skærme for at identificere nye lægemidler til SBNET-patienter. Da SBNET-cellelinjer ikke er alment tilgængelige, kan 3D-kulturer af SBNET sfæroider tjene som en ny in vitro-model til at studere SBNETs og kan deles blandt forskere i marken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

Små tarm Neuroendokrine tumorer (SBNETs) er sjældne kræftformer stammer fra enterochromaffin celler i tarmen. Forskningen på dette område har været begrænset, fordi der er genereret meget få patient afledte SBNET-cellelinjer. Veldifferentierede SBNET-celler er langsomt voksende og er svære at udbrede. De få cellelinjer, der er blevet etableret, er ikke umiddelbart tilgængelige, og efter tid i kulturen kan ikke fortsætte med at udtrykke egenskaber af netto celler. Generering af nye cellelinjer kan tage mange år siden SBNET celler har en lang fordobling tid og mange berigelse trin er nødvendige for at eliminere de hurtigt dividere Cancer-associerede fibroblaster. For at overvinde disse begrænsninger har vi udviklet en protokol til kultur-SBNET-celler fra kirurgisk fjernede tumorer som sfæroider i ekstracellulær matrix (ECM). ECM danner en 3-dimensionel matrix, der indkapater SBNET celler og efterligner tumor mikro-miljø for at tillade SBNET celler til at vokse. Her karakteriserede vi vækstraten af SBNET sfæroider og beskrev metoder til at identificere SBNET markører ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi og immun histokemi for at bekræfte, at sfæroider er neuroendokrine tumorceller. Derudover brugte vi sbnet sfæroider til afprøvning af cytotoksicitet af Rapamycin.

Der er i øjeblikket kun 2 sbnet cellelinjer etableret og offentliggjort2,3,4,5 og de er ikke umiddelbart tilgængelige for mange forskere. Her foreslår vi at kultur SBNET som sfæroider i ECM og bruge dette som en alternativ model til at studere SBNET stof følsomhed. Patient-afledte tumor fra en sbnet, der stase til leveren blev indsamlet, fordøjet at frigive sbnet celler, og blandet med fl...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Neuroendokrine tumorer (NETs) stammer fra neuroendokrine celler i neurale crest. De er langsomt voksende og udfordrende for kulturen. Vi præsenterer en alternativ strategi for at dyrke garn fra tyndtarmen ved at kulde dem som sfæroider. Disse sfæroider har små tarm NET markører og kan bruges til Drug test.

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Veldifferentierede SBNET-celler vokser langsomt og er svære at udbrede. De få etablerede cellelinjer er ikke umiddelbart tilgængelige for forskere. For at overvinde disse begrænsninger udviklede vi denne 3D-kulturprotokol.Fordelen ved denne teknik i forhold til den traditionelle metode til etablering af en SBNET cellelinje er, at 3D-kulturer kan opnås og test af lægemidler kan udføres inden for tre uger. Denne metode kan anvendes på andre neuroendokrine tumorer såsom neuroendokrine tumorer fra bugspytkirtlen. Efter at have fået en resected patient SBNET prøve, skær det i fem millimeter terninger og gemme det i 25 milliliter DMEM F12 medium i et konisk rør til transport.Inkuber tumorerne i vaskemedium, der er fremstillet i henhold til manuskriptretninger i 15 minutter. Derefter overføre dem til en ny skål og hakke dem til mindre end en millimeter stykker ved hjælp af sterile buede saks. Det hakkede væv overføres til et nyt 50 milliliterrør med 25 milliliter vaskemedium, hvortil der centrifugeres prøven ved 500 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius.Kassér supernatanten og opsplit pellets i 10 milliliter vaskemed kollagen og DNase. Lad de hakkede tumorer fordøje ved 37 grader Celsius med langsom rystelser i 90 minutter. Det er vigtigt ikke at over fordøje tumor prøver.For meget enzym eller længere inkubationstid vil dræbe SBNET-celler. Efter fordøjelsen er færdig, centrifuge røret ved 500 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten og opsplit pellet i 15 milliliter vaskemedium.Anluffe en 70 mikrometercellestuden oven på et nyt 50 milliliterrør og overfør 10 milliliter af vaskebufferen gennem s sien. Hvirvle vasken buffer inde i røret for at forhindre cellerne i at holde sig til siderne. Filtrer derefter cellesuspensionen gennem s sien.Centrifuge cellerne ved 500 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten og opslæm pellet i 200 mikroliter af vaskemedium. Placer røret på is og bruge fem mikroliter af cellerne til celletælling med et hæmocytometer.Beregn antallet af celler, gentag derefter centrifugering for at fjerne supernatanten og resuspenderede cellerne i flydende ECM i en koncentration på en million celler pr. milliliter. Dernæst overføre fem til 20 mikroliter af SBNET spheroids i ECM til en 96 brøndplade og placere pladen i en 37 grader Celsius inkubator at tillade den flydende ECM til at størkne. Tilføj 200 mikroliter af SBNET kulturmedium til hver brønd, der indeholder sfæroider eller kultur organoider i stamcellemedier som tidligere beskrevet.Brug en P1000 pipette til at overføre organoiderne til et 1,5 milliliterrør og centrifuge røret ved 1,500 gange g i et minut for at fjerne supernatanten. Vask kulturen med en milliliter PBS og centrifuge igen for at fjerne supernatanten. Derefter fastsætte organoids ved at tilføje 500 mikroliter af paraformaldehyd og inkubere dem i 15 minutter.Efter inkubationen vaskes kulturen to gange med en milliliter PBS. Tilføj 500 mikroliter af PBS med 3% BSA og 0,1% Triton X-100 for at gennemtrænge kulturen. Rørkuber røret i fem minutter, og vask derefter organoiderne tre gange med en milliliter PBS og 3%BSA.Dernæst inkuberes kulturen med primære antistoffer i en time, og derefter gentage vaskes vaskene med PBS og BSA. Inkuber med de sekundære antistoffer og gentag vaskene og sørg for at aspirere og kassere alle supernatant. For at afbilde sfæroiderne skal du tilføje fem mikroliter monteringsmedium, der indeholder DAPI, og bruge en P20-pipette til at overføre fem mikroliter af sfæroiderne til et glasdias.Forsegl diaset med en dækslet og et billede med et fluorescensmikroskop ved hjælp af 10-, 20- og 40X-målene. Bryd ECM mekanisk med en P1000-pipette, og overfør den til et sterilt 1,5 milliliterrør. Centrifuge røret ved 1, 000 gange g ved fire grader Celsius.Fjern derefter alle supernatant og læg røret på is. Tilføj to til fire gange mængden af nye ECM til pellet og bland indholdet af røret ved pipettering op og ned 10 gange og sørg for at undgå at indføre luftbobler. Overfør fem til 20 mikroliter af ECM- og SBNET-blandingen til en ny 96 brøndplade, og gør det muligt for ECM at størkne.Dæk derefter den størknede ECM med nyt SBNET-medium, og læg pladen i inkubatoren. Hvis SBNET-sfæroiderne til et andet laboratorium skal spheroider overføres med den nye ECM til en T25-kolbe, og ECM kan størkne. Fyld kolben med SBNET sfæroide medium, skru hætten på stramt, og forbered forsendelsespakken.Efter at have modtaget sfæroide kultur, fjerne kultur medium og gentag de foregående trin for at sætte sfæroider tilbage i kulturen. SBNET spheroid vækstrate blev overvåget med mikroskopisk billeddannelse. Det tager ca. 14 dage for SBNET sfæroider at fordoble i størrelse, når kulturmediet ændres en gang om ugen.Efter 14 dage i kultur, SBNET sfæroider ikke stige i størrelse. Sfæroiderne var plettet med antistoffer, der var specifikke mod synaptophysin, chromogranin A og SSTR2 og afbildet ved hjælp af immunfluorescensmikroskopi. Dataene viste, at disse markører er lokaliseret i cytoplasmaet og ved membranen af SBNET celler.For at sikre antistoffernes specificitet blev de samme farvningsprocedurer udført på en organoid linje fra en bugspytkirteltumor, der ikke udtrykker synaptophysin, chromogranin A og SSTR2, og der blev ikke fundet noget grønt signal. Den største fordel ved immunfluorescens billeddannelse er, at det kan udføres inden for fire timer og give lignende farvning oplysninger som immunhistrokemi. Culturing SBNET som sfæroider er en værdifuld teknik til at identificere lægemidler, der kan hæmme SBNET vækst.Sfæroiderne blev behandlet med rapamycin og mTOR-hæmmer. Efter fem dage dannede rapamycinbehandlet spheroid en druelignende struktur og blev apoptotisk eller nekrotisk. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at fordædre cellestuden og opsamlingsrøret med vaskemedium.Dette vil forhindre SBNET-celler i at holde sig til cellestingen og plastrøret. Med denne protokol, forskere og klinikere kan etablere SBNET sfæriske kulturer fra resected tumorer, dele dem med andre laboratorier, og bruge dem til at teste FDA godkendte lægemidler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Betjeningsprocedurer af Electrochemotherapy for Behandling af Tumor i Hunde og katte

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Udnyttelse af ultralyd guidede væv-instrueret cellulære Implantation for etablering af biologisk relevante metastatisk Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Hurtig optisk clearing til semi-høj gennemstrømningsanalyse af tumorsfæroider

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Vurdering af mitokondriel sundhed i kræftassocierede fibroblaster isoleret fra 3D multicellulære lungetumorsfæroider

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...