Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door NIH grants P50 CA174521 (aan J.R. Howe en A.M. Bellizzi). P.H. ear is een ontvanger van de P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.

Alle experimenten met behulp van menselijke neuro-endocriene tumormonsters zijn goedgekeurd door de Universiteit van Iowa ziekenhuis en klinieken IRB Comité (protocol nummer 199911057). Een lijst van alle materialen en apparatuur wordt beschreven in de tabel met materialen. In tabel 1vindt u een lijst met groeimedia en belangrijke oplossingen.
1. kleine darm neuroendocriene tumor (SBNET) collectie en celdissociatie
<ol><li>Verkrijgen van de patiënt SBNET m...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Tumor 3D culturen zijn uitgegroeid tot een waardevolle bron voor preklinische drug testen15. Verschillende tumor organoïde biobanken zijn onlangs opgericht uit borstkanker en prostaatkanker tumoren16,17. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol aan cultuur-SBNET als sferoïden en een eenvoudige en snelle methode om de spheroid-culturen voor netto-markers te valideren door immunofluorescentie en test geneesmiddel gevoeligheid. V...

Kleine darm neuroendocriene tumoren (SBNETs) zijn afkomstig van enterochromaffin cellen van de dunne darm. Hoewel sbnets over het algemeen bekend zijn dat ze langzaam groeien, metastaseren ze vaak naar de lever1. Terwijl de chirurgische verwijdering of tumor ablatie kan worden overwogen in veel gevallen, herhaling is bijna universeel, en, daarom, medische therapie speelt een belangrijke rol in het management. Er zijn enorme inspanningen geïnvesteerd om nieuwe SBNET-cellijnen voor het testen van geneesmiddelen te genereren. Er is echter weinig succes geboekt. Slechts 6 sbnetcellijnen (krj-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) zijn gemeld2,3,4,5; en helaas is één cellijn niet langer NET markers6 en drie andere sbnet cellijnen (krj-I, L-STS, H-STS) die zijn vastgesteld om te worden afgeleid van getransformeerde lymfoblasten in plaats van netten7. Om de identificatie van geneesmiddelen voor het targeten van SBNETs te versnellen, zijn alternatieve methoden voor in-vitro geneesmiddelen tests nodig.
Hier maken we gebruik van de beschikbaarheid van nieuwe sbnets en hebben we een manier gecreëerd om deze door patiënten afgeleide sbnets te kweken als sferoïden in ECM. Het algemene doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven voor cultuur sbnet als een driedimensionale (3D) cultuur en overzichts procedures om deze sferoïden te karakteriseren voor het bewaren van sbnet markers door immunofluorescentie kleuring en immunohistochemie.
Daarnaast tonen we aan hoe deze sbnet sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen van het effect van rapamycine, een anti-kanker medicijn voor NETs8. De achterliggende gedachte achter dit protocol is om een nieuwe methode te ontwikkelen om SBNET-cellen in vitro te laten groeien en deze te gebruiken voor het testen van medicijnen. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de traditionele methode voor het opzetten van een SBNET-cellijn is dat 3D-culturen van SBNETs snel kunnen worden verkregen en dat geneesmiddelen testen binnen 3 weken kunnen worden uitgevoerd. Sbnet sferoïden kan mogelijk worden gebruikt als model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelen schermen om nieuwe geneesmiddelen voor sbnet-patiënten te identificeren. Aangezien sbnet-cellijnen niet algemeen beschikbaar zijn, kunnen 3D-culturen van sbnet-sferoïden fungeren als een nieuw in vitro model voor het bestuderen van sbnets en kunnen worden gedeeld door wetenschappers in het veld.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

Kleine darm neuroendocriene tumoren (SBNETs) zijn zeldzame kankers afkomstig van enterochromaffin cellen van de darm. Onderzoek op dit gebied is beperkt omdat er zeer weinig patiënt afgeleide SBNET cellijnen zijn gegenereerd. Goed gedifferentieerde SBNET cellen zijn traag groeien en zijn moeilijk te propageren. De weinige cellijnen die zijn vastgesteld zijn niet direct beschikbaar, en na de tijd in de cultuur mag niet blijven om de kenmerken van de netto-cellen uit te drukken. Het genereren van nieuwe cellijnen kan vele jaren duren, omdat SBNET-cellen een lange verdubbelingstijd hebben en veel verrijkingsstappen nodig zijn om de snel delende kankergerelateerde fibroblasten te elimineren. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een protocol ontwikkeld om sbnet-cellen te kweken van operatief verwijderde tumoren als sferoïden in extracellulaire matrix (ECM). De ECM vormt een 3-dimensionale matrix die SBNET-cellen inkapt en de tumor micro-omgeving nabootst voor het laten groeien van SBNET-cellen. Hier kenmerkten we de groeisnelheid van sbnet sferoïden en beschreven methoden om sbnet-markers te identificeren met behulp van immunofluorescentie microscopie en immunohistochemie om te bevestigen dat de sferoïden neuroendocriene tumorcellen zijn. Daarnaast gebruikten we sbnet sferoïden voor het testen van de cytotoxiciteit van rapamycine.

Er zijn momenteel slechts 2 sbnet cellijnen opgericht en gepubliceerd2,3,4,5 en ze zijn niet direct beschikbaar voor veel onderzoekers. Hier stellen we voor om sbnet als sferoïden in ECM te kweken en dit als alternatief model te gebruiken om de gevoeligheid van het sbnet te bestuderen. Patiënt-afgeleide tumor van een sbnet dat uitgezaaid naar de lever werd verzameld, verteerd om sbnet cellen ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Neuro-endocriene tumoren (netten) zijn afkomstig van neuro-endocriene cellen van de neurale Crest. Ze zijn traag groeiend en uitdagend voor cultuur. We presenteren een alternatieve strategie om netten van de dunne darm te kweken door ze als spheroids te kweken. Deze sferoïden hebben kleine darmen net markers en kunnen worden gebruikt voor het testen van de drug.

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Goed gedifferentieerde SBNET cellen zijn langzaam groeiende en moeilijk te verspreiden. De weinige gevestigde cellijnen zijn niet direct beschikbaar voor onderzoekers. Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we dit 3D-cultuurprotocol.Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de traditionele methode van het opzetten van een SBNET-cellijn is dat 3D-culturen kunnen worden verkregen en dat drugstesten binnen drie weken kunnen worden uitgevoerd. Deze methode kan worden toegepast op andere neuro-endocriene tumoren, zoals neuro-endocriene tumoren uit de alvleesklier. Na het verkrijgen van een resected patiënt SBNET monster, snijd het in vijf millimeter kubussen en bewaar het in 25 milliliter van DMEM F12 medium in een conische buis voor transport.Broed de tumoren in wasmiddel bereid volgens manuscript richtingen gedurende 15 minuten. Breng ze vervolgens over naar een nieuwe schotel en maak ze gehakt tot minder dan een millimeter stukken met behulp van steriele gebogen schaar. Breng de gehakte weefsels in een nieuwe buis van 50 milliliter met 25 milliliter wasmiddel en centrifugeer het monster vervolgens 15 minuten bij vier graden Celsius op 500 g.Gooi de supernatant weg en verhoog de pellets in 10 milliliter wasmedium met collagenase en DNase. Laat de gehakte tumoren te verteren op 37 graden Celsius met langzaam schudden gedurende 90 minuten. Het is belangrijk om de tumormonsters niet te verteren.Te veel enzym of langere incubatietijd zal SBNET cellen doden. Nadat de spijsvertering is voltooid, centrifugeren de buis op 500 keer g gedurende 15 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in 15 milliliter wasmedium.Plaats een 70 micrometer celzeef op een nieuwe 50 milliliter buis en breng 10 milliliter van de wasbuffer door de zeef. Draai de wasbuffer in de buis om te voorkomen dat de cellen aan de zijkanten blijven plakken. Vervolgens filter de celopening door de zeef.Centrifugeren de cellen op 500 keer g gedurende 15 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in 200 microliter wasmedium. Plaats de buis op ijs en gebruik vijf microliter van de cellen voor het tellen van cellen met een hemocytometer.Bereken het aantal cellen, herhaal vervolgens de centrifugatie om de supernatant te verwijderen en de cellen in vloeibare ECM opnieuw op te hoogten bij een concentratie van één miljoen cellen per milliliter. Breng vervolgens vijf tot 20 microliter SBNET-sferoïden in ECM over naar een 96-putplaat en plaats de plaat in een 37 graden Celsius-incubator om de vloeibare ECM te laten stollen. Voeg 200 microliters van SBNET cultuurmedium toe aan elke put met sferoïden of cultuur van de organoïden in stamcelmedia zoals eerder beschreven.Gebruik een P1000 pipet om de organoïden over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter en de buis 1, 500 keer g gedurende een minuut te centrifugeren om de supernatant te verwijderen. Was de cultuur met een milliliter PBS en centrifuge opnieuw om de supernatant te verwijderen. Bevestig vervolgens de organoïden door 500 microliters paraformaldehyde toe te voegen en ze gedurende 15 minuten uit te broeden.Na de incubatie, was de cultuur twee keer met een milliliter PBS. Voeg 500 microliter PBS toe met 3%BSA en 0,1%Triton X-100 om de cultuur te doordrenteren. Incubeer de buis gedurende vijf minuten en was de organoïden vervolgens drie keer met één milliliter PBS en 3%BSA.Vervolgens, incubeer de cultuur met primaire antilichamen voor een uur dan herhaal de wasbeurten met PBS en BSA. Incubeer met de secundaire antilichamen en herhaal de wasbeurten om ervoor te zorgen dat alle supernatant aanzuigen en weggooien. Om de sferoïden in beeld te brengen, voeg je vijf microliters van montagemedium toe dat DAPI bevat en gebruik je een P20 pipet om vijf microliter van de sferoïden over te brengen naar een glazen glijbaan.Verzegel de dia met een coverslip en afbeelding met een fluorescentiemicroscoop met behulp van de 10, 20 en 40X doelstellingen. Breek de ECM mechanisch met een P1000 pipet en breng deze over naar een steriele buis van 1,5 milliliter. Centrifuge de buis op 1.000 keer g bij vier graden Celsius.Verwijder vervolgens alle supernatant en plaats de buis op ijs. Voeg twee tot vier keer het volume van de nieuwe ECM aan de pellet en meng de inhoud van de buis door pipetten op en neer 10 keer om ervoor te zorgen dat de invoering van luchtbellen te voorkomen. Breng vijf tot 20 microliter van het ECM- en SBNET-mengsel over op een nieuwe 96-putplaat en laat de ECM stollen.Bedek vervolgens de gestolde ECM met nieuw SBNET-medium en leg de plaat in de couveuse. Als sbnet-sferoïden naar een ander lab worden verzonden, brengt u de sferoïden met de nieuwe ECM over naar een T25-kolf en laat u de ECM stollen. Vul de kolf met SBNET sferoïde medium, schroef de dop stevig vast en bereid het verzendpakket voor.Bij ontvangst van de sferoïde cultuur, verwijder de cultuur medium en herhaal de vorige stappen om de sferoïden terug in de cultuur. SBNET sferoïde groeisnelheid werd gemonitord met microscopische beeldvorming. Het duurt ongeveer 14 dagen voor SBNET sferoïden te verdubbelen in omvang wanneer de cultuur media wordt veranderd een keer per week.Na 14 dagen in cultuur, SBNET sferoïden niet in omvang toenemen. De sferoïden waren bevlekt met antilichamen die specifiek zijn tegen synaptophysine, chromogranine A en SSTR2 en werden afgebeeld met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. De gegevens toonden aan dat deze markers zijn gelokaliseerd in het cytoplasma en op het membraan van SBNET cellen.Om de specificiteit van de antilichamen te waarborgen, werden dezelfde kleuringsprocedures uitgevoerd op een organoïde lijn van een alvleeskliertumor die geen synaptophysine, chromogranine A en SSTR2 uitdrukt en er geen groen signaal werd gedetecteerd. Het belangrijkste voordeel van immunofluorescentie beeldvorming is dat het binnen vier uur kan worden uitgevoerd en vergelijkbare kleuringsinformatie kan geven als de immunohistochemie. Culturing SBNET als sferoïden is een waardevolle techniek voor het identificeren van geneesmiddelen die SBNET groei kunnen remmen.De sferoïden werden behandeld met rapamycine en mTOR-remmer. Na vijf dagen vormde de met rapamycine behandelde sferoïde een druifachtige structuur en werd apoptotisch of necrotisch. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de celzeef en opvangbuis met wasmedium voor nat te maken.Dit voorkomt dat SBNET-cellen zich aan de celzeef en de plastic buis kleven. Met dit protocol, wetenschappers en clinici kunnen vestigen SBNET sferoïde culturen van gereseceerde tumoren, delen ze met andere laboratoria, en gebruik ze voor het testen van FDA goedgekeurde geneesmiddelen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Operating Procedures van de Electrochemotherapy voor de behandeling van de Tumor bij honden en katten

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Snelle optische clearing voor semi-high-throughput analyse van tumorsferoïden

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...