Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH P50 CA174521 (à J.R. Howe et A.M. Bellizzi). P.H. Ear est récipiendaire du prix P50 CA174521 Du Programme d'amélioration de carrière.

Toutes les expériences utilisant des échantillons neuroendocrines humains de tumeur ont été approuvées par le comité d'hôpital et de cliniques d'université de l'Iowa (numéro de protocole 199911057). Une liste de tous les matériaux et équipements est décrite dans le Tableau des matériaux. Une liste des médias de croissance et des solutions clés se trouve dans le tableau 1.
1. La collecte de la tumeur neuroendocrine des petites entrailles (SBNET) et...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Les cultures 3D tumorales sont devenues une ressource précieuse pour les tests précliniques15. Diverses biobanques organoïdes tumorales ont récemment été établies à partir du cancer du sein et des tumeurs du cancer de la prostate16,17. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé à la culture SBNET comme sphéroïdes et une méthode simple et rapide pour valider les cultures sphéroïdes pour les marqueurs NET par i...

Les petites tumeurs neuroendocrines d'entrailles (SBNETs) proviennent des cellules d'entérosochromaffin du petit intestin. Bien que les SBNETs soient généralement connus pour se développer lentement, ils métastasent généralement au foie1. Tandis que le déplacement chirurgical ou l'ablation de tumeur peut être considéré dans beaucoup de cas, la répétition est presque universelle, et, par conséquent, la thérapie médicale joue un rôle important dans la gestion. D'énormes efforts ont été investis pour générer de nouvelles lignées cellulaires SBNET pour le dépistage des drogues. Cependant, il y a eu très peu de succès. Seules 6 lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) ont été signalées2,3,4,5; et malheureusement, une lignée cellulaire n'exprime plus de marqueurs NET6 et trois autres lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) ont été déterminées à provenir de lymphoblastes transformés au lieu de NETs7. Afin d'accélérer l'identification des médicaments pour cibler les SBNET, d'autres méthodes de dépistage in vitro des drogues sont nécessaires.
Ici, nous profitons de la disponibilité des SBNETs réséqués et avons établi un moyen de cultiver ces SBNETs dérivés du patient comme des sphéroïdes de plus en plus en ECM. L'objectif global de ce manuscrit est de décrire une méthode de culture SBNET comme une culture tridimensionnelle (3D) et des procédures de contour pour caractériser ces sphéroïdes pour la rétention des marqueurs SBNET par la coloration immunofluorescence et l'immunohistochimie.
En outre, nous démontrons comment ces sphéroïdes SBNET peuvent être utilisés pour tester l'effet de la rapamycine, un médicament anticancéreux pour lesNET8. La raison d'être de ce protocole est de développer une nouvelle méthode pour cultiver les cellules SBNET in vitro et de les utiliser pour le dépistage des drogues. L'avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d'établissement d'une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D des SBNETs peuvent être rapidement obtenues et que des tests de dépistage de drogues peuvent être effectués dans les 3 semaines. Les sphéroïdes SBNET pourraient potentiellement être utilisés comme modèle pour effectuer des écrans de médicaments in vitro afin d'identifier de nouveaux médicaments pour les patients atteints de SBNET. Étant donné que les lignées cellulaires SBNET ne sont pas largement disponibles, les cultures 3D des sphéroïdes SBNET peuvent servir de nouveau modèle in vitro pour l'étude des SBNETs et peuvent être partagées entre les scientifiques dans le domaine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

Les tumeurs neuroendocrines de petite entrailles (SBNETs) sont des cancers rares provenant des cellules d'entéroochromaffin de l'intestin. La recherche dans ce domaine a été limitée parce que très peu de lignées cellulaires SBNET dérivées de patients ont été générées. Les cellules SBNET bien différenciées se développent lentement et sont difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires qui ont été établies ne sont pas facilement disponibles, et après le temps dans la culture peut ne pas continuer à exprimer des caractéristiques des cellules NET. La génération de nouvelles lignées cellulaires pourrait prendre de nombreuses années puisque les cellules SBNET ont un long temps de doublement et de nombreuses étapes d'enrichissement sont nécessaires afin d'éliminer les fibroblastes rapidement associés au cancer. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un protocole à la culture des cellules de SBNET des tumeurs chirurgicalement enlevées comme sphéroïdes dans la matrice extracellulaire (ECM). L'ECM forme une matrice tridimensionnelle qui encapsule les cellules SBNET et imite le micro-environnement tumoral pour permettre aux cellules SBNET de se développer. Ici, nous avons caractérisé le taux de croissance des sphéroïdes de SBNET et décrit des méthodes pour identifier des marqueurs de SBNET utilisant la microscopie et l'immunohistochimie d'immunofluorescence pour confirmer que les sphéroïdes sont des cellules neuroendocrines de tumeur. En outre, nous avons utilisé des sphéroïdes SBNET pour tester la cytotoxicité de la rapamycine.

Il n'y a actuellement que 2 lignées cellulaires SBNET établies et publiées2,3,4,5 et elles ne sont pas facilement disponibles pour de nombreux chercheurs. Ici, nous proposons à la culture SBNET comme sphéroïdes dans eCM et l'utiliser comme un modèle alternatif pour étudier la sensibilité des médicaments SBNET. La tumeur patient-dérivée d'un SBNET qui a métastasé au foie a été ra...

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Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Les tumeurs neuroendocrines (NET) proviennent des cellules neuroendocrines de la crête neurale. Ils sont à croissance lente et difficiles à la culture. Nous présentons une stratégie alternative pour cultiver des NETs des petites entrailles en les cultivant en tant que sphéroïdes. Ces sphéroïdes ont de petits marqueurs NET intestin et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues.

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Les cellules SBNET bien différenciées sont à croissance lente et difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires établies ne sont pas facilement accessibles aux chercheurs. Pour surmonter ces limites, nous avons développé ce protocole de culture 3D.L’avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d’établissement d’une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D peuvent être obtenues et le dépistage des drogues peut être fait dans les trois semaines. Cette méthode peut être appliquée à d’autres tumeurs neuroendocrines telles que les tumeurs neuroendocrines du pancréas. Après avoir obtenu un échantillon de SBNET du patient réséqué, coupez-le en cubes de cinq millimètres et rangez-le en 25 millilitres de milieu DMEM F12 dans un tube conique pour le transport.Incuber les tumeurs dans le milieu de lavage préparé selon les instructions manuscrites pendant 15 minutes. Ensuite, transférez-les dans un nouveau plat et hachez-les en morceaux de moins d’un millimètre à l’aide de ciseaux incurvés stériles. Transférer les tissus hachés dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 25 millilitres de milieu de lavage, puis centrifuger l’échantillon à 500 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 10 millilitres de milieu de lavage avec collagène et DNase. Laissez les tumeurs hachées digérer à 37 degrés Celsius avec des secousses lentes pendant 90 minutes. Il est important de ne pas trop digérer les échantillons tumoraux.Trop d’enzymes ou un temps d’incubation plus long tueront les cellules SBNET. Une fois la digestion terminée, centrifuger le tube à 500 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en 15 millilitres de lavauge moyenne.Placez une passoire à cellules de 70 micromètres sur un nouveau tube de 50 millilitres et transférez 10 millilitres du tampon de lavage à travers la passoire. Faites tourbillonner le tampon de lavage à l’intérieur du tube pour empêcher les cellules de coller sur les côtés. Filtrez ensuite la suspension cellulaire à travers la passoire.Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille dans 200 microlitres de lavauge moyenne. Placez le tube sur la glace et utilisez cinq microlitres des cellules pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.Calculer le nombre de cellules, puis répéter la centrifugation pour enlever le supernatant et resuspendre les cellules dans l’ECM liquide à une concentration d’un million de cellules par millilitre. Ensuite, transférez de cinq à 20 microlitres de sphéroïdes SBNET dans ecm à une plaque de puits de 96 et placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pour permettre à l’ECM liquide de se solidifier. Ajouter 200 microlitres de milieu de culture SBNET à chaque puits contenant des sphéroïdes ou de la culture des organoïdes dans les médias de cellules souches comme décrit précédemment.Utilisez une pipette P1000 pour transférer les organoïdes dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez le tube à 1 500 fois g pendant une minute pour enlever le surnatant. Laver la culture avec un millilitre de PBS et centrifugeuse à nouveau pour enlever le supernatant. Puis fixer les organoïdes en ajoutant 500 microlitres de paraformaldéhyde et en les incubant pendant 15 minutes.Après l’incubation, laver la culture deux fois avec un millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de PBS avec 3%BSA et 0,1%Triton X-100 pour perméabiliser la culture. Incuber le tube pendant cinq minutes, puis laver les organoïdes trois fois avec un millilitre de PBS et 3%BSA.Ensuite, incuber la culture avec des anticorps primaires pendant une heure, puis répéter les lavages avec PBS et BSA. Incuber avec les anticorps secondaires et répéter les lavages en s’assurant d’aspirer et de jeter tous les supernatants. Pour imager les sphéroïdes, ajoutez cinq microlitres de support de montage contenant du DAPI et utilisez une pipette P20 pour transférer cinq microlitres des sphéroïdes à une toboggan en verre.Scellez la diapositive avec un coverslip et une image avec un microscope à fluorescence à l’aide des objectifs 10, 20 et 40X. Casser mécaniquement l’ECM avec une pipette P1000 et la transférer dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Centrifugeuse le tube à 1000 fois g à quatre degrés Celsius.Retirez ensuite tout supernatant et placez le tube sur la glace. Ajouter deux à quatre fois le volume de nouveaux ECM à la pastille et mélanger le contenu du tube en pipetage de haut en bas 10 fois en s’assurant d’éviter d’introduire des bulles d’air. Transférer de cinq à 20 microlitres du mélange ECM et SBNET dans une nouvelle plaque de puits 96 et permettre à l’ECM de se solidifier.Couvrez ensuite l’ECM solidifié avec le nouveau support SBNET et mettez la plaque dans l’incubateur. Si vous expédiez des sphéroïdes SBNET dans un autre laboratoire, transférez les sphéroïdes avec le nouvel ECM dans un flacon T25 et permettez à l’ECM de se solidifier. Remplissez le flacon avec le milieu sphéroïde SBNET, vissez le bouchon bien et préparez l’emballage d’expédition.En recevant la culture sphéroïde, retirez le milieu de culture et répétez les étapes précédentes pour remettre les sphéroïdes en culture. Le taux de croissance sphéroïde de SBNET a été surveillé avec la formation image microscopique. Il faut environ 14 jours pour que les sphéroïdes SBNET doublent de taille lorsque le média culturel est changé une fois par semaine.Après 14 jours de culture, les sphéroïdes SBNET n’augmentent pas en taille. Les sphéroïdes ont été tachés avec des anticorps spécifiques contre la synaptophysine, la chromogranine A et le SSTR2 et photographiés à l’aide de microscopie d’immunofluorescence. Les données ont montré que ces marqueurs sont localisés dans le cytoplasme et à la membrane des cellules SBNET.Pour assurer la spécificité des anticorps, les mêmes procédures de coloration ont été exécutées sur une ligne organoïde d’une tumeur de pancréas qui n’exprime pas la synaptophysine, la chromogranine A et le SSTR2 et aucun signal vert n’a été détecté. Le principal avantage de la formation image d’immunofluorescence est qu’elle peut être exécutée dans un délai de quatre heures et donner l’information semblable de coloration que l’immunohistochimie. La culture du SBNET comme sphéroïdes est une technique précieuse pour identifier les médicaments qui peuvent inhiber la croissance du SBNET.Les sphéroïdes ont été traités avec la rapamycine et l’inhibiteur de mTOR. Après cinq jours, le sphéroïde traité à la rapamycine a formé une structure en forme de raisin et est devenu apoptotique ou nécrotique. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de pré-mouiller la passoire cellulaire et tube de collecte avec milieu de lavage.Cela empêchera les cellules SBNET de coller à la passoire cellulaire et au tube en plastique. Avec ce protocole, les scientifiques et les cliniciens peuvent établir des cultures sphéroïdes SBNET à partir de tumeurs réséquées, les partager avec d’autres laboratoires, et les utiliser pour tester les médicaments approuvés par la FDA.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Procédures de fonctionnement du Electrochimiothérapie pour le traitement des tumeurs chez les chiens et les chats

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilisation des ultrasons guidés axés sur les tissus cellulaire Implantation pour la mise en place de xénogreffes tumorales métastatiques biologiquement pertinente

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Nettoyage optique rapide pour l’analyse à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Évaluation de la santé mitochondriale dans les fibroblastes associés au cancer isolés à partir de sphéroïdes de tumeurs pulmonaires multicellulaires 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...