Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien P50 CA174521 (an J.R. Howe und A.M. Bellizzi) unterstützt. P.H. Ear ist Träger des P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.

Alle Experimente mit menschlichen neuroendokrinen Tumorproben wurden vom IRB-Ausschuss der University of Iowa Hospital and Clinics (Protokollnummer 199911057) genehmigt. Eine Liste aller Materialien und Ausrüstungen ist in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Eine Liste der Wachstumsmedien und Schlüssellösungen finden Sie in Tabelle 1.
1. Dünndarm neuroendokrinen Tumor (SBNET) Sammlung und Zelldissoziation
<ol><li>Erhalten Sie resektierte SBNET-Proben...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Tumor-3D-Kulturen sind zu einer wertvollen Ressource für präklinische Arzneimitteltests geworden15. Verschiedene Tumororganoid-Biobanken wurden vor kurzem aus Brustkrebs und Prostatakrebs Tumoren16,17etabliert. In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur SBNET als Sphäroide und eine einfache und schnelle Methode, um die Sphäroidkulturen für NET-Marker durch Immunfluoreszenz zu validieren und die Wirkstoffempfind...

Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) stammen aus Enterochromaffinzellen des Dünndarms. Obwohl SBNETs allgemein dafür bekannt sind, langsam zu wachsen, metastasieren sie häufig zur Leber1. Während die chirurgische Entfernung oder Tumorablation in vielen Fällen in Betracht gezogen werden kann, ist das Wiederauftreten fast universell, und daher spielt die medizinische Therapie eine wichtige Rolle im Management. Es wurden enorme Anstrengungen unternommen, um neue SBNET-Zelllinien für Arzneimitteltests zu generieren. Es gab jedoch nur sehr wenig Erfolg. Es wurdennur6 SBNET-Zelllinien (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) gemeldet 2,3,4,5; und leider drückt eine Zelllinie nicht mehr die NET-Marker6 aus und drei weitere SBNET-Zelllinien (KRJ-I, L-STS, H-STS) wurden bestimmt, aus transformierten Lymphoblasten anstelle von NETs7abgeleitet zu werden. Um die Identifizierung von Arzneimitteln für SBNETs zu beschleunigen, sind alternative Methoden für In-vitro-Arzneimitteltests erforderlich.
Hier nutzen wir die Verfügbarkeit von resezierten SBNETs und haben einen Weg etabliert, diese patientenabgeleiteten SBNETs als Sphäroide zu kultitonischen, die in ECM wachsen. Das übergeordnete Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Kultur von SBNET als dreidimensionale (3D) Kultur und Umrissverfahren zu beschreiben, um diese Sphäroide zur Beibehaltung von SBNET-Markern durch Immunfluoreszenzfärbung und Immunhistochemie zu charakterisieren.
Darüber hinaus zeigen wir, wie diese SBNET Sphäroide verwendet werden können, um die Wirkung von Rapamycin, einem Krebsmedikament für NETs8,zu testen. Der Grund für dieses Protokoll ist die Entwicklung einer neuen Methode, um SBNET-Zellen in vitro zu züchten und für Arzneimitteltests zu verwenden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber der traditionellen Methode zur Festlegung einer SBNET-Zelllinie besteht darin, dass 3D-Kulturen von SBNETs schnell gewonnen werden können und Arzneimitteltests innerhalb von 3 Wochen durchgeführt werden können. SBNET Sphäroide könnten möglicherweise als Modell für die Durchführung von In-vitro-Medikamentenscreens verwendet werden, um neue Medikamente für SBNET-Patienten zu identifizieren. Da SBNET-Zelllinien nicht weit verbreitet sind, können 3D-Kulturen von SBNET-Sphäroiden als neues In-vitro-Modell für die Untersuchung von SBNETs dienen und unter Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geteilt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) sind seltene Krebsarten, die aus Enterochromaffinzellen des Darms stammen. Die Forschung auf diesem Gebiet war begrenzt, da nur sehr wenige von Patienten abgeleitete SBNET-Zelllinien erzeugt wurden. Gut differenzierte SBNET-Zellen wachsen langsam und sind schwer zu vermehren. Die wenigen Zellenlinien, die festgelegt wurden, sind nicht ohne weiteres verfügbar, und nach der Zeit in der Kultur können die Eigenschaften von NET-Zellen nicht mehr zum Ausdruck kommen. Die Erzeugung neuer Zelllinien könnte viele Jahre dauern, da SBNET-Zellen eine lange Verdoppelungszeit haben und viele Anreicherungsschritte erforderlich sind, um die sich schnell trennenden krebsassoziierten Fibroblasten zu beseitigen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, um SBNET-Zellen aus chirurgisch entfernten Tumoren als Sphäroide in extrazellulärer Matrix (ECM) zu kultiieren. Das ECM bildet eine dreidimensionale Matrix, die SBNET-Zellen kapselt und die Tumor-Mikroumgebung imitiert, um SBNET-Zellen wachsen zu lassen. Hier charakterisierten wir die Wachstumsrate von SBNET Sphäroiden und beschriebene Methoden zur Identifizierung von SBNET-Markern mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Immunhistochemie, um zu bestätigen, dass es sich bei den Sphäroiden um neuroendokrine Tumorzellen handelt. Darüber hinaus verwendeten wir SBNET Sphäroide zur Prüfung der Zytotoxizität von Rapamycin.

Es gibt derzeit nur 2 SBNET Zelllinien etabliert und veröffentlicht2,3,4,5 und sie sind nicht leicht verfügbar für viele Forscher. Hier schlagen wir vor, SBNET als Sphäroide im ECM zu kultitoben und dies als alternatives Modell zur Untersuchung der SBNET-Arzneimittelempfindlichkeit zu verwenden. Patienten-abgeleiteter Tumor aus einem SBNET, der zur Leber metastasiert wurde, verdaut wurde, u...

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Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Neuroendokrine Tumoren (NETs) stammen aus neuroendokrinen Zellen des Neuralkamms. Sie sind langsam wachsend und herausfordernd für die Kultur. Wir präsentieren eine alternative Strategie, um NETs aus dem kleinen Darm zu züchten, indem wir sie als Sphäroide kultivieren. Diese Sphäroide haben kleine Darm-NET-Marker und können für Drogentests verwendet werden.

Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Gut differenzierte SBNET-Zellen wachsen langsam und schwer zu vermehren. Die wenigen etablierten Zelllinien sind den Forschern nicht ohne weiteres zugänglich. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir dieses 3D-Kulturprotokoll entwickelt.Der Vorteil dieser Technik gegenüber der traditionellen Methode zur Festlegung einer SBNET-Zelllinie besteht darin, dass 3D-Kulturen gewonnen und Drogentests innerhalb von drei Wochen durchgeführt werden können. Diese Methode kann auf andere neuroendokrine Tumoren wie neuroendokrine Tumoren aus der Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Nach Erhalt einer resektierten SBNET-Probe in fünf Millimeter würfeln und in 25 Milliliter DMEM F12 Medium in einem konischen Rohr für den Transport lagern.Inkubieren Sie die Tumoren in Waschmedium nach ManuskriptRichtungen für 15 Minuten vorbereitet. Dann auf eine neue Schale übertragen und mit einer sterilen gebogenen Schere auf weniger als einen Millimeter zerkleinern. Übertragen Sie das hackfleischte Gewebe in ein neues 50-Milliliter-Rohr mit 25 Milliliter Waschmedium, zentrifugieren Sie die Probe dann bei 500 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets in 10 Milliliter Waschmedium mit Kollagenase und DNase wieder auf. Lassen Sie die gehackten Tumore bei 37 Grad Celsius verdauen, wobei sie 90 Minuten lang langsam geschüttelt werden. Es ist wichtig, die Tumorproben nicht zu verdauen.Zu viel Enzym oder längere Inkubationszeit tötet SBNET-Zellen ab. Nach der Verdauung ist die Röhre bei 500 mal g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 15 Milliliter Waschmedium wieder auf.Legen Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb auf ein neues 50-Milliliter-Rohr und übertragen Sie 10 Milliliter des Waschpuffers durch das Sieb. Wirbeln Sie den Waschpuffer in der Röhre, um zu verhindern, dass die Zellen an den Seiten kleben. Filtern Sie dann die Zellsuspension durch das Sieb.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter Waschmedium wieder auf. Legen Sie die Röhre auf Eis und verwenden Sie fünf Mikroliter der Zellen für die Zellzählung mit einem Hämozytometer.Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, wiederholen Sie dann die Zentrifugation, um den Überstand zu entfernen und die Zellen in flüssigem ECM mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter wieder auszusetzen. Als nächstes übertragen Sie fünf bis 20 Mikroliter SBNET Sphäroide in ECM auf eine 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius Inkubator, damit sich das flüssige ECM erstarren lässt. Fügen Sie 200 Mikroliter SBNET Kulturmedium zu jedem Brunnen enthaltensphäroide oder Kultur die Organoide in Stammzellmedien wie zuvor beschrieben.Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Organoide auf ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen und das Rohr mit 1, 500 mal g für eine Minute zu zentrifugieren, um den Überstand zu entfernen. Waschen Sie die Kultur mit einem Milliliter PBS und Zentrifuge wieder, um den Überstand zu entfernen. Dann fixieren Sie die Organoide, indem Sie 500 Mikroliter Paraformaldehyd hinzufügen und sie für 15 Minuten inkubieren.Waschen Sie die Kultur nach der Inkubation zweimal mit einem Milliliter PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS mit 3%BSA und 0,1%Triton X-100 hinzu, um die Kultur zu durchdringen. Inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten, dann waschen Sie die Organoide dreimal mit einem Milliliter PBS und 3%BSA.Als nächstes inkubieren Sie die Kultur mit primären Antikörpern für eine Stunde und wiederholen Sie dann die Wähzahlen mit PBS und BSA. Mit den sekundären Antikörpern bebrüten und die Wässer wiederholen, um sicherzustellen, dass alle Überstande angesaugt und verworfen werden. Um die Sphäroide abzubilden, fügen Sie fünf Mikroliter Montagemedium mit DAPI hinzu und verwenden Sie eine P20-Pipette, um fünf Mikroliter der Sphäroide auf einen Glasschlitten zu übertragen.Versiegeln Sie das Dia mit einem Coverslip und einem Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den 10-, 20- und 40-fachen Objektiven. Brechen Sie das ECM mechanisch mit einer P1000 Pipette und übertragen Sie es in ein steriles 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1 000 mal g bei vier Grad Celsius.Dann entfernen Sie alle Überstand und legen Sie die Röhre auf Eis. Fügen Sie das zwei- bis vierfache Volumen des neuen ECM in das Pellet ein und mischen Sie den Inhalt des Rohres, indem Sie zehnmal nach oben und unten pfeifen und sicherstellen, dass luftblasen vermieden wird. Fünf bis 20 Mikroliter der ECM- und SBNET-Mischung auf eine neue 96-Well-Platte übertragen und das ECM festigen lassen.Dann bedecken Sie das erstarrte ECM mit neuem SBNET Medium und legen Sie die Platte in den Inkubator. Wenn Sie SBNET Spheroide an ein anderes Labor versenden, übertragen Sie die Sphäroide mit dem neuen ECM in einen T25-Kolben, und lassen Sie das ECM festigen. Füllen Sie den Kolben mit SBNET Sphäroid Medium, schrauben Sie die Kappe fest auf, und bereiten Sie das Versandpaket.Nach Erhalt der Sphäroidkultur entfernen Sie das Kulturmedium und wiederholen Sie die vorherigen Schritte, um die Sphäroide wieder in die Kultur zu versetzen. Die Wachstumsrate des SBNET-Sphäroids wurde mit mikroskopischer Bildgebung überwacht. Es dauert etwa 14 Tage, bis sich SBNET Spheroids verdoppeln, wenn die Kulturmedien einmal pro Woche gewechselt werden.Nach 14 Tagen in der Kultur werden SBNET Sphäroide nicht größer. Die Sphäroide wurden mit Antikörpern gefärbt, die spezifisch gegen Synaptophysin, Chromogranin A und SSTR2 sind, und mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die Daten zeigten, dass diese Marker im Zytoplasma und an der Membran von SBNET-Zellen lokalisiert sind.Um die Spezifität der Antikörper zu gewährleisten, wurden die gleichen Färbungsverfahren an einer Organoidlinie aus einem Bauchspeicheldrüsentumor durchgeführt, der kein Synaptophysin, Chromogranin A und SSTR2 ausdrückt und kein grünes Signal erkannt wurde. Der Hauptvorteil der Immunfluoreszenz-Bildgebung ist, dass sie innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden kann und ähnliche Färbeinformationen wie die Immunhistochemie geben kann. SBNET als Sphäroide zu kultivieren ist eine wertvolle Technik zur Identifizierung von Medikamenten, die das SBNET-Wachstum hemmen können.Die Sphäroide wurden mit Rapamycin und MTOR-Hemmer behandelt. Nach fünf Tagen bildete das mit Rapamycin behandelte Sphäroid eine traubenartige Struktur und wurde apoptotisch oder nekrotisch. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, das Zellsieb und das Sammelrohr mit Waschmittel vorzubefeuchten.Dadurch wird verhindert, dass SBNET-Zellen am Zellsieb und am Kunststoffrohr kleben. Mit diesem Protokoll können Wissenschaftler und Kliniker SBNET Sphäroidkulturen aus resezierten Tumoren herstellen, sie mit anderen Laboratorien teilen und sie für die Prüfung von FDA-zugelassenen Medikamenten verwenden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Die Arbeitsverfahren der Elektrochemotherapie zur Behandlung von Tumor bei Hunden und Katzen

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Forschung

Krebsforschung

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Rapid Optical Clearing für die Semi-Hochdurchsatzanalyse von Tumorsphäroiden

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in krebsassoziierten Fibroblasten, die aus 3D-multizellulären Lungentumor-Sphäroiden isoliert wurden

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...