Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים P50 CA174521 (למען י. י. האו ו-בליצי). P.H. האוזן הוא הנמען של הפרס P50 CA174521 הקריירה תוכנית שיפור.

כל הניסויים באמצעות דגימות גידולים נוירואנדוקריניים אנושיים אושרו על ידי אוניברסיטת איווה החולים והוועדה IRB (פרוטוקול מספר 199911057). רשימה של כל החומרים והציוד מתוארת בטבלת החומרים. בטבלה 1מצויים רשימה של מדיית צמיחה ופתרונות מפתח.
1. המעי הגס קטן גידול נוירו?...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

גידולים 3D הגידול הפכו משאב רב ערך עבור בדיקות תרופות טרום קלינית15. הגידול שונים אורגנואיד ביואידים הוקמו לאחרונה מסרטן השד וסרטן הערמונית גידולים16,17. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתרבות SBNET כמו spheroids ושיטה פשוטה ומהירה כדי לאמת את התרבוי...

קטן גידולים נוירואנדוקריניים (SBNETs) מקורם תאים enterochromaffin של המעי הדק. למרות ש-SBNETs ידועים בדרך כלל כשהם גדלים לאט, הם בדרך כלל מגרורות לכבד1. בעוד הסרת כירורגי או אבלציה הגידול יכול להיחשב במקרים רבים, הישנות היא כמעט אוניברסלית, ולכן, טיפול רפואי ממלא תפקיד חשוב בניהול. מאמצים עצומים הושקעו כדי ליצור חדש שורות SBNET תאים עבור בדיקות סמים. עם זאת, היתה מעט מאוד הצלחה. רק 6 שורות של תאי sbnet (krj-I, CND2, GOT1, P-sts, L-sts, H-sts) דווחו2,3,4,5; ולמרבה הצער קו תא אחד כבר לא מבטא סמנים נטו6 ושלושה אחרים sbnet תאים קווי (krj-I, L-Sts, H-sts) היו נחושים להיות נגזר lymphoblasts השתנה במקום רשתות7. כדי להאיץ את זיהוי התרופות לצורך התמקדות בבקרי גבול, יש צורך בשיטות חלופיות לבדיקת סמים מחוץ לרשת.
כאן, אנו מנצלים את הזמינות של SBNETs מחדש והקמנו דרך לתרבות אלה בעלי מטופלים שנוצרו על ידי המטופל כספרואידים הגדלים ב-ECM. המטרה הכוללת של כתב היד הזה היא לתאר שיטה לתרבות SBNET כתלת-מימדי (3D) תרבות והליכי חלוקה לרמות כדי לאפיין את הספרואידים לשמירת סמנים SBNET על ידי immunofluorescence כתמים ואימונוהיסטוכימיה.
בנוסף, אנו מדגימים כיצד אלה מזהי SBNET הניתנים לשימוש לבדיקת ההשפעה של rapamycin, תרופה נגד סרטן עבור רשתות8. הרציונל מאחורי פרוטוקול זה הוא לפתח שיטה חדשה לגדל בתאי SBNET בתוך מבחנה ולהשתמש בהם לבדיקת סמים. היתרון של טכניקה זו על השיטה המסורתית של הקמת קו SBNET cell היא כי תרבויות תלת-ממד של Sbnet ניתן להשיג במהירות ובדיקות סמים ניתן לעשות בתוך 3 שבועות. מסנני SBNET יכולים לשמש כמודל לביצוע מסכי סמים מחוץ לרשת כדי לזהות תרופות חדשות עבור מטופלים מסוג SBNET. מאז SBNET קווי התאים אינם זמינים באופן נרחב, 3D תלת-ממד של SBNET spheroids יכול לשמש כמודל חדש בתחום החוץ לחקר בקרי Sbnet וניתן לשתף בין מדענים בשדה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

קטן גידולים נוירואנדוקריניים (SBNETs) הם סוגי סרטן נדירים שמקורם בתאי enterochromaffin של הבטן. מחקר בתחום זה היה מוגבל כי מעט מאוד החולה נגזר שורות ברשת SBNET נוצרו. תאים SBNET מובחנת היטב הם איטיים הגדלים וקשה להפיץ. קווי התאים הבודדים שהוקמו אינם זמינים, ולאחר זמן בתרבות לא ניתן להמשיך לבטא את המאפיינים של תאי NET. יצירת קווי תא חדש יכול להימשך שנים רבות מאז SBNET תאים יש זמן הכפלה ארוכה ושלבי העשרה רבים נחוצים כדי לחסל במהירות חלוקת סרטן הקשורים באופן מהיר. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול התרבות SBNET תאים מפני גידולים שהוסרו בניתוח כמו spheroids ב מטריצה החילוץ (ECM). ECM צורות מטריצה תלת ממדית העוטף בתאי SBNET ומחקה את הגידול מיקרו הסביבה לאפשר לתאי SBNET לצמוח. כאן, אנו לאפיין את שיעור הצמיחה של SBNET spheroids מתוארים שיטות כדי לזהות סמנים SBNET באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence ואימונוהיסטוכימיה כדי לאשר כי spheroids הם תאי גידול נוירואנדוקריניים. בנוסף, השתמשנו ב-SBNET spheroids לבדיקת רעילות ציטופצין של rapamycin.

יש כרגע רק 2 sbnet שורות תא שהוקמו ופורסמו2,3,4,5 והם לא זמינים לחוקרים רבים. כאן, אנו מציעים תרבות SBNET כמו spheroids ב ECM ולהשתמש בזה כמודל אלטרנטיבי לחקור את רגישות התרופה SBNET. החולה-נגזר הגידול מתוך SBNET כי גרורות לכבד נאסף, מתעכל ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

גידולים נוירואנדוקריניים (רשתות) מקורם בתאים נוירואנדוקריניים של הרכס העצבי. הם הולך ומאתגר לאט לתרבות. אנו מציגים אסטרטגיה חלופית לגידול רשתות מהמעי הקטן על ידי הקפדה עליהם כספרואידים. הספרואידים הללו יש המעי הקטן סמנים נטו יכול לשמש בדיקות סמים.

הקמה ואפיון של המעי הקטן נוירואנדוקרינים הגידול האנדוקרינית

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

תאי SBNET מובחנים היטב גדלים לאט וקשה להפיץ אותם. קווי התאים המעטים שהוקמו אינם זמינים לחוקרים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול תרבות תלת-מימדי זה.היתרון של טכניקה זו על השיטה המסורתית של הקמת קו תא SBNET הוא כי תרבויות 3D ניתן להשיג בדיקות סמים ניתן לעשות בתוך שלושה שבועות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על גידולים נוירואנדוקריניים אחרים כגון גידולים נוירואנדוקריניים מהלבלב. לאחר קבלת דגימת SBNET חולה חתוכה, לחתוך אותו לקוביות חמישה מילימטר ולאחסן אותו 25 מיליליטר של אמצעי DMEM F12 בצינור חרוט להובלה.דגירה הגידולים במדיום לשטוף מוכן על פי הוראות כתב יד במשך 15 דקות. לאחר מכן מעבירים אותם לצלחת חדשה וטחון אותם לחתיכות פחות ממילימטר אחד באמצעות מספריים מעוקל סטרילי. מעבירים את הרקמות הטחון לצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של מדיום שטיפה, ואז צנטריפוגה הדגימה ב 500 פעמים g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את הכדורים ב-10 מיליליטר של מדיום שטיפה עם קולגנס ו-DNase. אפשר לגידולים הטחון לעכל ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות איטיות במשך 90 דקות. חשוב לא לעכל יתר על כן את דגימות הגידול.יותר מדי אנזים או זמן דגירה ארוך יותר יהרוג תאי SBNET. לאחר סיום העיכול, צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-15 מיליליטר של מדיום שטיפה.מניחים מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי צינור חדש 50 מיליליטר ולהעביר 10 מיליליטר של חיץ לשטוף דרך מסננת. מערבל את חיץ הכביסה בתוך הצינור כדי למנוע מהתאים להידבק לצדדים. ואז לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת.צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיום שטיפה. מניחים את הצינור על קרח ולהשתמש חמישה microliters של התאים לספירת תאים עם המוציטומטר.לחשב את מספר התאים, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה כדי להסיר את supernatant ולתלות מחדש את התאים ב- ECM נוזלי בריכוז של מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, להעביר חמישה עד 20 microliters של spheroids SBNET ב ECM לצלחת 96 גם ולמקם את הצלחת באינקובטור 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר את ECM נוזלי להתגבש. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבות SBNET לכל באר המכילה כדוריות או תרבות האורגנואידים במדיה של תאי גזע כפי שתואר קודם לכן.השתמש P1000 פיפטה להעביר את האורגנואידים לצינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגה הצינור ב 1, 500 פעמים גרם לדקה אחת כדי להסיר את העל טבעי. לשטוף את התרבות עם מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה שוב כדי להסיר את supernatant. לאחר מכן לתקן את האורגנואידים על ידי הוספת 500 microliters של paraformaldehyde ודגירה אותם במשך 15 דקות.לאחר הדגירה, לשטוף את התרבות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. הוסף 500 מיקרוליטרים של PBS עם 3%BSA ו-0.1% טריטון X-100 כדי לחלחל לתרבות. דגירה הצינור במשך חמש דקות, ולאחר מכן לשטוף את האורגנואידים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS ו 3% BSA.לאחר מכן, הדגירה את התרבות עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה אחת ואז לחזור על לשטוף עם PBS ו BSA. דגירה עם הנוגדנים המשניים ולחזור על לשטוף הקפדה שאף ולהשליך את כל על טבעי. כדי לדמיין את הכדורים, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה המכיל DAPI ולהשתמש בפיגט P20 כדי להעביר חמישה מיקרוליטרים של הכדורואידים לשקופית זכוכית.לאטום את השקופית עם כיסוי ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרות 10, 20 ו 40X. באופן מכני לשבור את ECM עם פיפטה P1000 ולהעביר אותו צינור סטרילי 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 1, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס.ואז להסיר את כל supernatant ולה מניחים את הצינור על קרח. הוסף פעמיים עד ארבע פעמים את הנפח של ECM חדש גלולה ומערבבים את התוכן של הצינור על ידי צינור למעלה ולמטה 10 פעמים הקפדה להימנע החדרת בועות אוויר. העבר חמישה עד 20 מיקרוליטרים של תערובת ECM ו- SBNET לצלחת באר חדשה של 96 ומאפשרים ל- ECM להתגבש.לאחר מכן לכסות את ECM מוצק עם מדיום SBNET חדש ולשים את הצלחת באינקובטור. אם משלוח SBNET spheroids למעבדה אחרת, להעביר את הכדורידים עם ECM החדש לבקבוק T25 ולאפשר ECM להתגבש. ממלאים את הבקבוק במדיום כדורי SBNET, דופקים היטב את המכסה ומכינים את חבילת המשלוח.עם קבלת התרבות הכדורית, הסר את מדיום התרבות וחזור על הצעדים הקודמים כדי להחזיר את הכדורים לתרבות. קצב הצמיחה הכדורי SBNET היה במעקב עם הדמיה מיקרוסקופית. זה לוקח בערך 14 ימים עבור spheroids SBNET להכפיל את גודל כאשר התקשורת התרבותית משתנה פעם בשבוע.לאחר 14 ימים בתרבות, כדורי SBNET אינם גדלים. הכדורואידים היו מוכתמים בנוגדנים ספציפיים נגד סינפטופיצין, כרומוגרנין A ו- SSTR2 ודימוי באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence. הנתונים הראו כי סמנים אלה הם מקומיים בציטופלסמה וב קרום של תאי SBNET.כדי להבטיח את הספציפיות של הנוגדנים, אותם הליכי הכתמה בוצעו על קו אורגנואידים מגידול בלבלב שאינו מבטא סינפטופיצין, כרומוגרנין A ו- SSTR2 ולא זוהה אות ירוק. היתרון העיקרי של הדמיה immunofluorescence הוא שזה יכול להתבצע בתוך ארבע שעות ולתת מידע מכתים דומה כמו immunohistochemistry. Culturing SBNET כמו כדוריות היא טכניקה יקרת ערך לזיהוי תרופות שיכול לעכב את הצמיחה SBNET.הספרואידים טופלו במעכבי ראפמיצין ו-mTOR. לאחר חמישה ימים, הכדוריד שטופל בראפאמיצין יצר מבנה דמוי ענבים והפך לאפופטוטי או נמק. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להרטיב מראש את מסננת התא ואת צינור האיסוף עם מדיום לשטוף.פעולה זו תמנע מתאי SBNET להידבק למאמץ התאים ולצינור הפלסטיק. עם פרוטוקול זה, מדענים וקלינאים יכולים להקים תרבויות spheroid SBNET מגידולים חצויים, לשתף אותם עם מעבדות אחרות, ולהשתמש בהם לבדיקת תרופות שאושרו על ידי ה-FDA.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

נוהלי עבודה של Electrochemotherapy לטיפול גידול בכלבים וחתולים

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

הערכה של בריאות המיטוכונדריה בפיברובלסטים הקשורים לסרטן שבודדו מספרואידים של גידולי ריאה רב-תאיים תלת-ממדיים

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...