Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha ricevuto il p50 CA174521 Career Enhancement Program.

Tutti gli esperimenti che utilizzano campioni di tumore neuroendocrino umano sono stati approvati dal comitato IRB dell'Università dell'Iowa Hospital and Clinics (numero di protocollo 199911057). Un elenco di tutti i materiali e le attrezzature è descritto nella Tabella dei Materiali. Un elenco di supporti di crescita e soluzioni chiave è disponibile nella tabella 1.
1. Raccolta di tumore intestinale piccolo (SBNET) e dissociazione cellulare
<ol><li>Otten...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Le colture 3D tumorali sono diventate una risorsa preziosa per i test preclinici sui farmaci15. Varie biobanche organoidi tumorali sono stati recentemente stabiliti da cancro al seno e tumori del cancro alla prostata16,17. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato alla cultura SBNET come sferoidi e un metodo semplice e veloce per convalidare le colture sferoidi per i marcatori NET mediante immunofluorescenza e testare la sensibi...

I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCRIT) provengono da cellule enterochromaffine dell'intestino tenue. Anche se gli SBNET sono generalmente noti per crescere lentamente, comunemente metastatizzano al fegato1. Mentre la rimozione chirurgica o l'ablazione del tumore può essere considerata in molti casi, la ricorrenza è quasi universale e, quindi, la terapia medica svolge un ruolo importante nella gestione. Sono stati investiti enormi sforzi per generare nuove linee cellulari SBNET per i test antidroga. Tuttavia, c'è stato molto poco successo. Solo 6 linee di celle SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) sono state segnalate2,3,4,5; e purtroppo una linea cellulare non esprime più i marcatori NET6 e altre tre linee cellulari SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) sono state determinate per essere derivate da linfoblasti trasformati invece di NET7. Al fine di accelerare l'identificazione dei farmaci per il targeting degli SBNET, sono necessari metodi alternativi per il test dei farmaci in vitro.
Qui, sfruttiamo la disponibilità di SBNET resezionati e abbiamo stabilito un modo per coltivare questi SBNET derivati dal paziente come sferoidi in crescita in ECM. L'obiettivo generale di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo alla cultura SBNET come una cultura tridimensionale (3D) e delineare le procedure per caratterizzare questi sferoidi per la conservazione dei marcatori SBNET mediante colorazione immunofluorescenza e immunohistochimica.
Inoltre, dimostriamo come questi sferoidi SBNET possono essere utilizzati per testare l'effetto della rapamicina, un farmaco anti-cancro per NET8. La logica alla base di questo protocollo è quello di sviluppare un nuovo metodo per far crescere le cellule SBNET in vitro e usarle per i test antidroga. Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D di SBNETs possono essere rapidamente ottenute e test antidroga possono essere eseguiti entro 3 settimane. Gli sferoidi SBNET potrebbero essere potenzialmente utilizzati come modello per l'esecuzione di schermi di farmaci in vitro per identificare nuovi farmaci per i pazienti SBNET. Poiché le linee cellulari SBNET non sono ampiamente disponibili, le colture 3D degli sferoidi SBNET possono servire come nuovo modello in vitro per studiare gli SBNET e possono essere condivise tra gli scienziati del settore.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCR) sono tumori rari provenienti da cellule enterocrombaffina dell'intestino. La ricerca in questo campo è stata limitata perché sono state generate pochissime linee cellulari SBNET derivate dal paziente. Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e sono difficili da propagare. Le poche linee cellulari che sono state stabilite non sono prontamente disponibili, e dopo il tempo nella coltura potrebbero non continuare ad esprimere le caratteristiche delle cellule NET. La generazione di nuove linee cellulari potrebbe richiedere molti anni perché le cellule SBNET hanno un lungo tempo di raddoppio e sono necessari molti passaggi di arricchimento per eliminare i fibroblasti associati al cancro. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle cellule SBNET dai tumori rimossi chirurgicamente come sferoidi nella matrice extracellulare (ECM). L'ECM forma una matrice tridimensionale che incapsula le cellule SBNET e imita il microambiente tumorale per consentire alle cellule SBNET di crescere. Qui, abbiamo caratterizzato il tasso di crescita degli sferoidi SBNET e descritto i metodi per identificare i marcatori SBNET usando la microscopia immunofluorescenza e l'immunohistochimica per confermare che gli sferoidi sono cellule tumorali neuroendocrine. Inoltre, abbiamo usato sferoidi SBNET per testare la citotossicità della rapamicina.

Attualmente ci sono solo 2 linee cellulari SBNET stabilite e pubblicate2,3,4,5 e non sono prontamente disponibili per molti ricercatori. Qui, proponiamo alla cultura SBNET come sferoidi in ECM e usiamo questo come un modello alternativo per studiare la sensibilità ai farmaci SBNET. Il tumore derivato dal paziente da un SBNET che metastatizzato al fegato è stato raccolto, digerito per rilascia...

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Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

I tumori neuroendocrini (NET) provengono da cellule neuroendocrine della cresta neurale. Sono in crescita lenta e impegnativi per la cultura. Vi presentiamo una strategia alternativa per far crescere le piccole viscere cullandoli come sferoidi. Questi sferoidi hanno piccoli marcatori di rete intestinale e possono essere utilizzati per i test antidroga.

Istituzione e caratterizzazione degli spheroeroidi del tumore intestinale piccolo intestinale

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e difficili da propagare. Le poche linee cellulari stabilite non sono prontamente disponibili per i ricercatori. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato questo protocollo di cultura 3D.Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D possono essere ottenute e il test dei farmaci può essere fatto entro tre settimane. Questo metodo può essere applicato ad altri tumori neuroendocrini come i tumori neuroendocrini del pancreas. Dopo aver ottenuto un campione SBNET del paziente risigillato, tagliarlo a cubetti di cinque millimetri e conservarlo in 25 millilitri di mezzo DMEM F12 in un tubo conico per il trasporto.Incubare i tumori nel mezzo di lavaggio preparato secondo le indicazioni manoscritte per 15 minuti. Quindi trasferirli su un nuovo piatto e tritarli in pezzi di meno di un millimetro usando forbici curve sterili. Trasferire i tessuti tritati in un nuovo tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di mezzo di lavaggio, quindi centrifugare il campione a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di mezzo di lavaggio con collagenasi e DNasi. Lasciare digerire i tumori tritati a 37 gradi Celsius con scuotimento lento per 90 minuti. È importante non digerire e più volte i campioni di tumore.Troppi enzimi o tempi di incubazione più lunghi uccideranno le cellule SBNET. Al termine della digestione, centrifugare il tubo a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 15 millilitri di mezzo di lavaggio.Posizionare un colino a celle di 70 micrometri sopra un nuovo tubo da 50 millilitri e trasferire 10 millilitri del tampone di lavaggio attraverso il filtro. Ruotare il tampone di lavaggio all'interno del tubo per evitare che le cellule si attacchino ai lati. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso il filtro.Centrifugare le cellule a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 200 microlitri di mezzo di lavaggio. Posizionare il tubo sul ghiaccio e utilizzare cinque microlitri delle cellule per il conteggio delle cellule con un emocitometro.Calcolare il numero di cellule, quindi ripetere la centrifugazione per rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in ECM liquido ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Successivamente, trasferire da cinque a 20 microlitri di sferoidi SBNET in ECM su una piastra di pozzo da 96 e posizionare la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius per consentire all'ECM liquido di solidificarsi. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura SBNET a ciascun pozzo contenente sferoidi o coltura gli organoidi nei mezzi delle cellule staminali come descritto in precedenza.Utilizzare una pipetta P1000 per trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugare il tubo a 1.500 volte g per un minuto per rimuovere il supernatante. Lavare la coltura con un millilitro di PBS e centrifugare di nuovo per rimuovere il supernatante. Quindi fissare gli organoidi aggiungendo 500 microlitri di paraformaldeide e incubandoli per 15 minuti.Dopo l'incubazione, lavare la coltura due volte con un millilitro di PBS. Aggiungere 500 microlitri di PBS con 3%BSA e 0,1%Triton X-100 per permeabilizzare la coltura. Incubare il tubo per cinque minuti, quindi lavare gli organoidi tre volte con un millilitro di PBS e 3%BSA.Successivamente, incubare la coltura con anticorpi primari per un'ora, quindi ripetere i lavaggi con PBS e BSA. Incubare con gli anticorpi secondari e ripetere i lavaggi assicurandosi di aspirare e scartare tutti i supernatanti. Per immaginire gli sferoidi, aggiungere cinque microlitri di supporto contenente DAPI e utilizzare una pipetta P20 per trasferire cinque microlitri degli sferoidi in uno scivolo di vetro.Sigillare lo scivolo con un coverslip e un'immagine con un microscopio a fluorescenza utilizzando gli obiettivi 10, 20 e 40X. Rompere meccanicamente l'ECM con una pipetta P1000 e trasferirlo in un tubo sterile da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 1.000 volte g a quattro gradi Celsius.Quindi rimuovere tutti i supernatanti e posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere da due a quattro volte il volume del nuovo ECM al pellet e mescolare il contenuto del tubo tubazione su e giù 10 volte assicurandosi di evitare l'introduzione di bolle d'aria. Trasferire da cinque a 20 microlitri della miscela ECM e SBNET su una nuova piastra da 96 pozza e consentire all'ECM di solidificarsi.Quindi coprire l'ECM solidificato con il nuovo mezzo SBNET e mettere la piastra nell'incubatore. Se si spedono sferoidi SBNET in un altro laboratorio, trasferire gli sferoidi con il nuovo ECM in un pallone T25 e consentire all'ECM di solidificarsi. Riempire il pallone con mezzo sferoide SBNET, avvitare saldamente il cappuccio e preparare il pacco di spedizione.Dopo aver ricevuto la cultura dello sferoide, rimuovere il mezzo di coltura e ripetere i passaggi precedenti per rimettere gli sferoidi in cultura. Il tasso di crescita dello sferoide SBNET è stato monitorato con immagini microscopiche. Ci vogliono circa 14 giorni perché gli sferoidi SBNET raddoppino quando i supporti di coltura vengono cambiati una volta alla settimana.Dopo 14 giorni di coltura, gli sferoidi SBNET non aumentano di dimensioni. Gli sferoidi sono stati macchiati con anticorpi specifici contro la sinaptofisina, la cromogranina A e lo SSTR2 e sono stati con immagini utilizzando la microscopia ad immunofluorescenza. I dati hanno mostrato che questi marcatori sono localizzati nel citoplasma e nella membrana delle cellule SBNET.Per garantire la specificità degli anticorpi, le stesse procedure di colorazione sono state eseguite su una linea organoide da un tumore del pancreas che non esprime sinaptofisina, cromogranina A e SSTR2 e non è stato rilevato alcun segnale verde. Il vantaggio principale dell'imaging ad immunofluorescenza è che può essere eseguito entro quattro ore e fornire informazioni di colorazione simili a quella dell'immunoistochimica. Coltivare SBNET come sferoidi è una tecnica preziosa per identificare i farmaci che possono inibire la crescita di SBNET.Gli sferoidi sono stati trattati con rapamicina e inibitore del mTOR. Dopo cinque giorni, lo sferoide trattato con rapamicina formò una struttura simile all'uva e divenne apoptotico o necrotico. Quando si tenta questa procedura, è importante pre-bagnare il filtro cellulare e il tubo di raccolta con mezzo di lavaggio.Ciò impedirà alle cellule SBNET di attaccarsi al filtro cellulare e al tubo di plastica. Con questo protocollo, scienziati e clinici possono stabilire colture sferoidi SBNET da tumori resected, condividerli con altri laboratori e usarli per testare i farmaci approvati dalla FDA.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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