Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH P50 CA174521 (a J.R. Howe y A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha recibido el premio P50 CA174521 Career Enhancement Program.

Todos los experimentos con muestras de tumores neuroendocrinos humanos han sido aprobados por el comité IRB de hospitales y clínicas de la Universidad de Iowa (número de protocolo 199911057). En la Tabla de materialesse describe una lista de todos los materiales y equipos. En la Tabla 1se encuentra una lista de medios de crecimiento y soluciones clave.
1. Recogida de tumor neuroendocrino del intestino delgado (SBNET) y disociación celular
<ol><li>Obtener...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Los cultivos 3D tumorales se han convertido en un recurso valioso para las pruebas de fármacos preclínicos15. Recientemente se han establecido varios biobancos organoides tumorales a partir de tumores de cáncer de mama y de cáncer de próstata16,17. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el cultivo de SBNET como esferoides y un método simple y rápido para validar los cultivos de esferoides para marcadores NET por...

Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) se originan en las células enterocromafina del intestino delgado. Aunque los SBNET son generalmente conocidos por crecer lentamente, comúnmente hacen metástasis en el hígado1. Si bien la extirpación quirúrgica o la ablación tumoral se pueden considerar en muchos casos, la recurrencia es casi universal y, por lo tanto, la terapia médica desempeña un papel importante en el manejo. Se han invertido enormes esfuerzos para generar nuevas líneas celulares SBNET para pruebas de drogas. Sin embargo, ha habido muy poco éxito. Sólo se han notificado 6 líneas de celda SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5; y desafortunadamente una línea celular ya no expresa los marcadores NET6 y otras tres líneas celulares SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) se determinó que se derivan de linfoblastos transformados en lugar de NETs7. Con el fin de acelerar la identificación de medicamentos para la focalización de los SBNET, se necesitan métodos alternativos para las pruebas de drogas in vitro.
Aquí, aprovechamos la disponibilidad de SBNET resecados y hemos establecido una manera de cultivar estos SBNET derivados del paciente como esferoides que crecen en ECM. El objetivo general de este manuscrito es describir un método para cultivar SBNET como una cultura tridimensional (3D) y esbozar procedimientos para caracterizar estos esferoides para la retención de marcadores SBNET por tinción de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica.
Además, demostramos cómo estos esferoides SBNET se pueden utilizar para probar el efecto de la rapamicina, un fármaco contra el cáncer para neTs8. La razón detrás de este protocolo es desarrollar un nuevo método para cultivar células SBNET in vitro y usarlas para pruebas de drogas. La ventaja de esta técnica sobre el método tradicional de establecer una línea celular SBNET es que los cultivos 3D de SBNET se pueden obtener rápidamente y las pruebas de drogas se pueden hacer dentro de 3 semanas. Los esferoides de SBNET podrían utilizarse potencialmente como modelo para realizar pantallas de medicamentos in vitro para identificar nuevos fármacos para pacientes con SBNET. Dado que las líneas celulares SBNET no están ampliamente disponibles, los cultivos 3D de esferoides SBNET pueden servir como un nuevo modelo in vitro para el estudio de los SBNET y pueden compartirse entre los científicos en el campo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) son cánceres raros que se originan a partir de células enterocromafina del intestino. La investigación en este campo ha sido limitada porque se han generado muy pocas líneas celulares SBNET derivadas de pacientes. Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y son difíciles de propagar. Las pocas líneas de celda que se han establecido no están fácilmente disponibles, y después del tiempo en el cultivo puede no seguir expresando características de las celdas NET. La generación de nuevas líneas celulares podría tardar muchos años ya que las células SBNET tienen un tiempo de duplicación largo y se necesitan muchos pasos de enriquecimiento para eliminar los fibroblastos asociados al cáncer que se dividen rápidamente. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un protocolo para cultivar células SBNET de tumores extirpados quirúrgicamente como esferoides en la matriz extracelular (ECM). El ECM forma una matriz tridimensional que encapsula las células SBNET e imita el microambiente tumoral para permitir que las células SBNET crezcan. Aquí, caracterizamos la tasa de crecimiento de los esferoides de SBNET y describimos métodos para identificar marcadores SBNET utilizando microscopía de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para confirmar que los esferoides son células tumorales neuroendocrinas. Además, utilizamos esferoides SBNET para probar la citotoxicidad de la rapamicina.

Actualmente sólo hay 2 líneas celulares SBNET establecidas y publicadas2,3,4,5 y no están fácilmente disponibles para muchos investigadores. Aquí, proponemos cultivar SBNET como esferoides en ECM y utilizar esto como un modelo alternativo para estudiar la sensibilidad a los medicamentos SBNET. Se recogió un tumor derivado del paciente de un SBNET que hizo metástasis en el hígado, se dig...

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Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Los tumores neuroendocrinos (NET) se originan a partir de células neuroendocrinas de la cresta neural. Son de crecimiento lento y desafiantes para la cultura. Presentamos una estrategia alternativa para cultivar NETs desde el intestino delgado cultándolos como esferoides. Estos esferoides tienen marcadores de red intestinal pequeña y se pueden utilizar para pruebas de drogas.

Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y difíciles de propagar. Las pocas líneas celulares establecidas no están fácilmente disponibles para los investigadores. Para superar estas limitaciones, desarrollamos este protocolo de cultura 3D.La ventaja de esta técnica sobre el método tradicional de establecer una línea celular SBNET es que se pueden obtener cultivos 3D y se pueden realizar pruebas de drogas en tres semanas. Este método se puede aplicar a otros tumores neuroendocrinos como tumores neuroendocrinos del páncreas. Después de obtener una muestra SBNET de paciente resegurado, córtela en cubos de cinco milímetros y guárdela en 25 mililitros de DMEM F12 medio en un tubo cónico para el transporte.Incubar los tumores en medio de lavado preparado según las instrucciones del manuscrito durante 15 minutos. Luego transfiéralos a un nuevo plato y picarlos a menos de un milímetro usando tijeras curvas estériles. Transfiera los tejidos picados a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medio de lavado, luego centrifugar la muestra a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets en 10 mililitros de medio de lavado con colagenasa y DNase. Permita que los tumores picados digieren a 37 grados Celsius con temblor lento durante 90 minutos. Es importante no digerir en exceso las muestras del tumor.Demasiada enzima o tiempo de incubación más largo matará a las células SBNET. Una vez finalizada la digestión, centrifuga el tubo a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 15 mililitros de medio de lavado.Coloque un colador celular de 70 micrómetros encima de un nuevo tubo de 50 mililitros y transfiera 10 mililitros del tampón de lavado a través del colador. Gire el tampón de lavado dentro del tubo para evitar que las células se peguen a los lados. A continuación, filtre la suspensión celular a través del colador.Centrifugar las células a 500 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 microlitros de medio de lavado. Coloque el tubo sobre hielo y utilice cinco microlitros de las células para el recuento celular con un hemocitoómetro.Calcular el número de células, luego repetir la centrifugación para eliminar el sobrenadante y resuspender las células en ECM líquido a una concentración de un millón de células por mililitro. A continuación, transfiera de cinco a 20 microlitros de esferoides SBNET en ECM a una placa de 96 pozos y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius para permitir que el ECM líquido se solidifique. Añadir 200 microlitros de medio de cultivo SBNET a cada bien que contenga esferoides o cultivo de los organoides en los medios de células madre como se describió anteriormente.Utilice una pipeta P1000 para transferir los organoides a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugar el tubo a 1.500 veces g durante un minuto para extraer el sobrenadante. Lave el cultivo con un mililitro de PBS y centrífuga de nuevo para eliminar el sobrenadante. A continuación, fije los organoides añadiendo 500 microlitros de paraformaldehído e incubando durante 15 minutos.Después de la incubación, lave el cultivo dos veces con un mililitro de PBS. Añadir 500 microlitros de PBS con 3%BSA y 0.1%Triton X-100 para permeabilizar el cultivo. Incubar el tubo durante cinco minutos, luego lavar los organoides tres veces con un mililitro de PBS y 3%BSA.A continuación, incubar el cultivo con anticuerpos primarios durante una hora y luego repetir los lavados con PBS y BSA. Incubar con los anticuerpos secundarios y repetir los lavados asegurándose de aspirar y desechar todo sobrenadante. Para tomar una imagen de los esferoides, agregue cinco microlitros de medio de montaje que contengan DAPI y utilice una pipeta P20 para transferir cinco microlitros de los esferoides a un portaobjetos de vidrio.Selle la diapositiva con un cubreobjetos y una imagen con un microscopio de fluorescencia utilizando los objetivos 10, 20 y 40X. Romper mecánicamente el ECM con una pipeta P1000 y transferirlo a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 1.000 g a cuatro grados centígrados.A continuación, retire todo el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo. Añadir de dos a cuatro veces el volumen del nuevo ECM al pellet y mezclar el contenido del tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces asegurándose de evitar la introducción de burbujas de aire. Transfiera de cinco a 20 microlitros de la mezcla ECM y SBNET a una nueva placa de 96 pozos y permita que el ECM se solidifique.A continuación, cubra el ECM solidificado con el nuevo medio SBNET y coloque la placa en la incubadora. Si envía esferoides SBNET a otro laboratorio, transfiera los esferoides con el nuevo ECM a un matraz T25 y permita que el ECM se solidifique. Llene el matraz con el medio esferoide SBNET, atornille bien la tapa y prepare el paquete de envío.Al recibir el cultivo de esferoides, retire el medio de cultivo y repita los pasos anteriores para volver a poner los esferoides en el cultivo. La tasa de crecimiento del esferoide SBNET fue monitoreada con imágenes microscópicas. Los esferoides SBNET tardan aproximadamente 14 días en duplicarse en tamaño cuando los medios de referencia cultural se cambian una vez a la semana.Después de 14 días en la cultura, los esferoides SBNET no aumentan de tamaño. Los esferoides se tiñeron con anticuerpos específicos contra la sinaptofisina, la cromogranina A y el SSTR2 y se fueron imageinados con microscopía de inmunofluorescencia. Los datos mostraron que estos marcadores están localizados en el citoplasma y en la membrana de las células SBNET.Para garantizar la especificidad de los anticuerpos, se realizaron los mismos procedimientos de tinción en una línea organoides a partir de un tumor de páncreas que no expresa sinaptofisina, cromogranina A y SSTR2 y no se detectó ninguna señal verde. La principal ventaja de las imágenes de inmunofluorescencia es que se puede realizar en cuatro horas y dar información de tinción similar a la inmunohistoquímica. Culturing SBNET as spheroids es una técnica valiosa para identificar fármacos que pueden inhibir el crecimiento de SBNET.Los esferoides fueron tratados con rapamicina e inhibidor de mTOR. Después de cinco días, el esferoide tratado con rapamicina formó una estructura similar a la uva y se volvió apoptótico o necrótico. Al intentar este procedimiento, es importante pre-mojar el colador celular y el tubo de recolección con medio de lavado.Esto evitará que las células SBNET se peguen al colador celular y al tubo de plástico. Con este protocolo, los científicos y clínicos pueden establecer cultivos esferoides SBNET a partir de tumores resecados, compartirlos con otros laboratorios y usarlos para probar medicamentos aprobados por la FDA.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Procedimientos de Operación del Electroquimioterapia para el tratamiento de un tumor en perros y gatos

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Limpieza óptica rápida para el análisis de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...