Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grants P50 CA174521 (till Jr Howe och A.M. Bellizzi). P.H. ear är mottagare av P50 CA174521 karriär Enhancement program Award.

Alla experiment med Human neuroendokrina tumör prover har godkänts av University of Iowa Hospital and Clinics IRB kommittén (protokollnummer 199911057). En lista över alla material och all utrustning beskrivs i material tabellen. En lista över tillväxtmedia och nyckellösningar finns i tabell 1.
1. liten tarm neuroendokrina tumör (SBNET) insamling och cell dissociation
<ol><li>Få resected PATIENTSBNET prover efter tumör vävnader bekräftelse från ...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Tumör 3D-kulturer har blivit en värdefull resurs för prekliniska drogtester15. Olika tumör Organoid biobanker har nyligen etablerats från bröstcancer och prostatacancertumörer16,17. I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll till kultur SBNET som spheroids och en enkel och snabb metod för att validera sfäroid kulturer för netto markörer genom immunofluorescensbildning och test läkemedels känslighet. Från vår erfarenhet k...

Små tarm neuroendokrina tumörer (SBNETs) härstammar från enterochromaffin celler i tunntarmen. Även om sbnets är allmänt kända för att växa långsamt, de ofta metastasera till levern1. Medan kirurgiskt avlägsnande eller tumör ablation kan övervägas i många fall, upprepning är nästan universell, och, därför, medicinsk behandling spelar en viktig roll i förvaltningen. Enorma ansträngningar har investerats för att generera nya SBNET cellinjer för drogtester. Men det har varit mycket liten framgång. Endast 6 sbnet cellinjer (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) har rapporterats2,3,4,5; och tyvärr en cell linje inte längre uttrycker netto markörer6 och tre andra sbnet cellinjer (KRJ-I, L-STS, H-STS) bestämdes att härledas från transformerade lymfoblaster i stället för nät7. För att påskynda identifieringen av läkemedel för att inrikta sig på SBNETs, behövs alternativa metoder för in vitro-drogtester.
Här drar vi nytta av tillgängligheten av resected SBNETs och har etablerat ett sätt att odla dessa patient-härledda SBNETs som spheroids växer i ECM. Det övergripande målet med detta manuskript är att beskriva en metod för att odla SBNET som en tredimensionell (3D) kultur och skissera förfaranden för att karakterisera dessa spheroids för bibehållande av SBNET markörer genom immunofluorescensfärgning och immunohistokemi.
Dessutom visar vi hur dessa SBNET spheroids kan användas för att testa effekten av rapamycin, en anti-cancerläkemedel för NETs8. Logiken bakom detta protokoll är att utveckla en ny metod för att odla SBNET-celler in vitro och använda dem för drogtester. Fördelen med denna teknik över den traditionella metoden för att etablera en SBNET cellinjer är att 3D-kulturer av SBNETs snabbt kan erhållas och drogtester kan göras inom 3 veckor. SBNET spheroids kan potentiellt användas som en modell för att utföra in vitro-läkemedel skärmar för att identifiera nya läkemedel för SBNET patienter. Eftersom SBNET cellinjer inte är allmänt tillgängliga, 3D-kulturer av SBNET spheroids kan fungera som en ny in vitro-modell för att studera SBNETs och kan delas mellan forskare inom området.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

Små tarm neuroendokrina tumörer (SBNETs) är sällsynta cancerformer som härrör från enterochromaffin celler i tarmen. Forskning inom detta område har begränsats eftersom mycket få patient härledda SBNET cellinjer har genererats. Väl differentierade SBNET celler är långsamt växande och är svåra att propagera. De få cell linjer som har upprättats är inte lätt tillgängliga, och efter tid i kulturen får inte fortsätta att uttrycka egenskaper hos netto celler. Generera nya cellinjer kan ta många år sedan SBNET celler har en lång fördubbling tid och många berikande steg behövs för att eliminera den snabbt dividera cancer-associerade fibroblaster. För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat ett protokoll till kultur SBNET celler från kirurgiskt borttagna tumörer som spheroids i extracellulära matrix (ECM). ECM bildar en 3-dimensionell matris som kapslar SBNET celler och härmar tumören mikro-miljö för att tillåta SBNET celler att växa. Här har vi karakteriserat tillväxttakten för SBNET spheroids och beskrivna metoder för att identifiera SBNET markörer med hjälp av immunofluorescensmikroskopi och immunohistokemi för att bekräfta att spheroids är neuroendokrina tumörceller. Dessutom använde vi SBNET spheroids för att testa cytotoxicitet av rapamycin.

Det finns för närvarande endast 2 sbnet cellinjer etablerade och publicerade2,3,4,5 och de är inte lätt tillgängliga för många forskare. Här föreslår vi att kulturen SBNET som spheroids i ECM och använda detta som en alternativ modell för att studera SBNET läkemedels känslighet. Patient-derived tumör från en sbnet att metastaserat till levern samlades, smält för att frigöra s...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Neuroendokrina tumörer (NETs) härstammar från neuroendokrina celler i neurala Crest. De är långsamt växande och utmanande för kulturen. Vi presenterar en alternativ strategi för att odla nät från tunntarm genom odling av dem som spheroids. Dessa spheroids har små tarm nät markörer och kan användas för drogtester.

Etablering och karakterisering av små tarm neuroendokrina tumör spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Väldifferentierade SBNET-celler växer långsamt och är svåra att fortplanta sig. De få etablerade cellinjerna är inte lätt tillgängliga för forskare. För att övervinna dessa begränsningar utvecklade vi detta 3D-kulturprotokoll.Fördelen med denna teknik jämfört med den traditionella metoden för att etablera en SBNET cellinje är att 3D-kulturer kan erhållas och drogtester kan göras inom tre veckor. Denna metod kan tillämpas på andra neuroendokrina tumörer såsom neuroendokrina tumörer från bukspottkörteln. Efter att ha erhållit en resected patient SBNET prov, skär den i fem millimeter kuber och lagra den i 25 milliliter dmem F12 medium i ett koniskt rör för transport.Inkubera tumörerna i tvättmedium förberett enligt manuskriptriktningar i 15 minuter. Sedan överföra dem till en ny maträtt och finhacka dem till mindre än en millimeter bitar med hjälp av sterila böjda sax. Överför de malda vävnaderna till ett nytt 50 milliliterrör som innehåller 25 milliliter tvättmedium, sedan centrifug provet på 500 gånger g i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Kassera supernatanten och resuspend pelletsen i 10 milliliter av tvättmedel med kollagenas och DNase. Låt de malda tumörerna smälta vid 37 grader Celsius med långsam skakning i 90 minuter. Det är viktigt att inte över smälta tumörproverna.För mycket enzym eller längre inkubationstid kommer att döda SBNET celler. Efter matsmältningen är klar, centrifug röret vid 500 gånger g i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 15 milliliter tvättmedel.Placera en 70 mikrometer cellsil ovanpå ett nytt 50 milliliterrör och överför 10 milliliter av tvättbufferten genom silen. Snurra tvättbufferten inuti röret för att förhindra att cellerna fastnar på sidorna. Filtrera sedan cellupphängningen genom silen.Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och resuspend pelleten i 200 mikroliter av tvättmedel. Placera röret på is och använd fem mikroliter av cellerna för cellräkning med en hemocytometer.Beräkna antalet celler, upprepa sedan centrifugeringen för att avlägsna supernatanten och återanvänd cellerna i flytande ECM vid en koncentration av en miljon celler per milliliter. Därefter överför fem till 20 mikroliter av SBNET sfäroider i ECM till en 96 brunnsplatta och placera plattan i en 37 grader Celsius inkubator för att låta vätskan ECM att stelna. Lägg till 200 mikroliter av SBNET odlingsmedium till varje brunn som innehåller sfäroider eller odla de organoider i stamcellsmedia som tidigare beskrivits.Använd en P1000-pipett för att överföra organoiderna till ett 1,5 milliliterrör och centrifugera röret vid 1, 500 gånger g i en minut för att avlägsna supernatanten. Tvätta kulturen med en milliliter av PBS och centrifug igen för att ta bort supernatanten. Sedan fixa organoider genom att lägga till 500 mikroliter av paraformaldehyd och inkubera dem i 15 minuter.Efter inkubationen tvättar du kulturen två gånger med en milliliter PBS. Lägg till 500 mikroliter pbs med 3%BSA och 0,1%Triton X-100 för att genomsyra kulturen. Inkubera röret i fem minuter, tvätta sedan organoiderna tre gånger med en milliliter PBS och 3%BSA.Därefter inkubera kulturen med primära antikroppar i en timme och upprepa sedan tvättarna med PBS och BSA. Inkubera med de sekundära antikropparna och upprepa tvättar se till att aspirera och kassera alla supernatant. För att avbilda sfäroiderna, tillsätt fem mikroliter av monteringsmedium som innehåller DAPI och använd en P20-pipett för att överföra fem mikroliter av sfäroiderna till en glasrutschbana.Försegla bilden med en coverslip och bild med fluorescensmikroskop med hjälp av målen 10, 20 och 40X. Bryt ECM:en mekaniskt med en P1000-pipett och överför den till ett sterilt 1,5 milliliterrör. Centrifugera röret vid 1, 000 gånger g vid fyra grader Celsius.Ta sedan bort all supernatant och placera röret på is. Lägg till två till fyra gånger volymen av nya ECM till pelleten och blanda innehållet i röret genom pipettering upp och ner 10 gånger se till att undvika att införa luftbubblor. Överför fem till 20 mikroliter av ECM- och SBNET-blandningen till en ny brunnsplatta på 96 och låt ECM stelna.Täck sedan den stelnade ECM med nytt SBNET medium och lägg plattan i inkubatorn. Om frakt SBNET sfäroider till ett annat labb, överför sfäroiderna med den nya ECM till en T25 kolv och låta ECM att stelna. Fyll kolven med SBNET sfäroid medium, skruva fast locket på tätt, och förbereda fraktpaketet.När du får sfäroidkulturen tar du bort odlingsmediet och upprepar de tidigare stegen för att sätta tillbaka sfäroiderna i kulturen. SBNET sfäroid tillväxttakt övervakades med mikroskopisk avbildning. Det tar ungefär 14 dagar för SBNET-spheroids att fördubblas i storlek när odlingsmedierna ändras en gång i veckan.Efter 14 dagar i kultur ökar inte SBNET-spheroiderna i storlek. De sfäroider var färgas med antikroppar specifika mot synaptophysin, chromogranin A och SSTR2 och avbildas med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Uppgifterna visade att dessa markörer är lokaliserade i cytoplasman och vid membranet av SBNET celler.För att säkerställa specificiteten hos antikropparna, samma färgning förfaranden utfördes på en organoid linje från en bukspottkörteln tumör som inte uttrycker synaptophysin, chromogranin A och SSTR2 och ingen grön signal upptäcktes. Den största fördelen med immunofluorescens imaging är att den kan utföras inom fyra timmar och ge liknande färgning information som den immunohistokemi. Culturing SBNET som sfäroider är en värdefull teknik för att identifiera läkemedel som kan hämma SBNET tillväxt.Sfäroiderna behandlades med rapamycin och mTOR-hämmare. Efter fem dagar bildade rapamycin-behandlade sfäroid en druva-liknande struktur och blev apoptotiska eller nekrotiska. Vid försök till detta förfarande är det viktigt att förväta cellsilen och uppsamlingsröret med tvättmedium.Detta kommer att förhindra SBNET celler från att fastna på cellen sil och plaströret. Med detta protokoll, forskare och kliniker kan upprätta SBNET sfäroid kulturer från resected tumörer, dela dem med andra laboratorier, och använda dem för att testa FDA godkända läkemedel.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Rutiner i Electrochemotherapy för behandling av tumör i hundar och katter

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Användningen av ultraljud guidade vävnad-regisserad cellulära Implantation för etableringen av biologiskt relevanta metastaserande tumör xenograft

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Längsgående morfologiska och fysiologiska övervakning av tredimensionella tumör Spheroids använder optisk koherenstomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Snabb optisk rensning för semi-high-throughput analys av tumörsfäroider

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Bedömning av mitokondriell hälsa vid cancerassocierade fibroblaster isolerade från 3D multicellulära lungtumörsfäroider

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablera 3-dimensionella sfäroider från patient-härledda tumörprover och utvärdera deras känslighet för läkemedel

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...