Name: establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids
Uploaded: 2019-10-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Bu çalışma NIH'nin P50 CA174521 (J.R. Howe ve A.M. Bellizzi'ye) verdiği hibelerle desteklenmiştir. P.H. Ear, P50 CA174521 Kariyer Geliştirme Programı ödülüne layık görülmüştür.

İnsan nöroendokrin tümör örnekleri kullanılarak yapılan tüm deneyler Iowa Üniversitesi Hastanesi ve Klinikleri IRB komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 199911057). Tüm malzeme ve ekipmanların listesi Malzeme Tablosu'ndaaçıklanmıştır. Büyüme ortamı ve anahtar çözümlerlistesi Tablo 1'debulunmaktadır.
1. İnce barsak nöroendokrin tümör (SBNET) toplanması ve hücre bölünmesi
<ol><li>Cerrahi Patoloji Çekirdeğind...

<ol>
	<li>Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+Diagnostics+and+Therapeutics+in+Pancreatic+Neuroendocrine+Tumors.">Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+continuous+cell+line+from+a+human+carcinoid+of+the+small+intestine+(KRJ-I).">Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I).</a> International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).</li><li>Kolby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transplantable+human+carcinoid+as+model+for+somatostatin+receptor-mediated+and+amine+transporter-mediated+radionuclide+uptake.">A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake.</a> American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).</li><li>Van Buren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+characterization+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line.">The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line.</a> Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).</li><li>Pfragner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+three+novel+cell+lines+-+P-STS,+L-STS,+H-STS+-+derived+from+a+human+metastatic+midgut+carcinoid.">Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid.</a> Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).</li><li>Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varying+opinions+on+the+authenticity+of+a+human+midgut+carcinoid+cell+line--letter.">Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter.</a> Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).</li><li>Hofving, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+phenotype,+genomic+profile+and+therapeutic+sensitivity+of+GEPNET+cell+lines.">The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines.</a> Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).</li><li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+of+rapamycin+and+octreotide+as+single+agents+or+in+combination+in+neuroendocrine+tumors.">Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors.</a> Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).</li><li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Patient-Derived+Organoids+and+Drug+Screening+for+Biliary+Tract+Carcinoma.">Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma.</a> Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).</li><li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bone+marrow+metastases+of+neuroblastoma+with+immunohistochemical+staining+of+CD56,+chromogranin+A,+and+synaptophysin.">Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin.</a> Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).</li><li>Clifton-Bligh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diagnosis+of+tumor-induced+osteomalacia+with+Gallium-68+DOTATATE+PET/CT.">Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).</li><li>Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation,+Expansion,+and+Cryopreservation+of+Human+Primary+Tissue-Derived+Normal+and+Diseased+Organoids+in+Embedded+Three-Dimensional+Culture.">Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).</li><li>Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethidium+dimer:+a+new+reagent+for+the+fluorimetric+determination+of+nucleic+acids.">Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).</li><li>Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Organoids+as+a+Pre-clinical+Cancer+Model+for+Drug+Discovery.">Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172, 373-386 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communication. 9, 2404 (2018).</li><li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSTR2-based+reporters+for+assessing+gene+transfer+into+non-small+cell+lung+cancer:+evaluation+using+an+intrathoracic+mouse+model.">SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model.</a> Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).</li></ol>

Tümör 3D kültürleri preklinik ilaç testi için değerli bir kaynak haline gelmiştir15. Çeşitli tümör organoid biobanks son zamanlarda meme kanseri ve prostat kanseri tümörlerikurulmuştur 16,17. Bu çalışmada, spheroids olarak kültür SBNET için ayrıntılı bir protokol ve immünofloresan ve test ilaç duyarlılığı ile NET belirteçleri için küresel kültürleri doğrulamak için basit ve hızlı bir yöntem sağlar. ...

İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) ince bağırsağın enterokromfin hücrelerinden kaynaklanır. SBNETs genellikle yavaş büyümek için bilinen olmasına rağmen, genellikle karaciğer1metastaz . Cerrahi kaldırma veya tümör ablasyon birçok durumda düşünülebilir iken, nüks neredeyse evrensel, ve bu nedenle, tıbbi tedavi yönetiminde önemli bir rol oynar. Uyuşturucu testi için yeni SBNET hücre hatları oluşturmak için muazzam çabalar gösterilmiştir. Ancak, çok az başarı olmuştur. Sadece 6 SBNET hücre hattı (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) bildirilmiştir2,3,4,5; ve ne yazık ki bir hücre hattı artık NET belirteçleri6 ve diğer üç SBNET hücre hatları (KRJ-I, L-STS, H-STS) nets yerine dönüştürülmüş lenfoblastlar türetilmiş olduğu tespit edilmiştir ifade eder7. SBNETs hedeflemeiçin ilaçların belirlenmesini hızlandırmak için, in vitro uyuşturucu testi için alternatif yöntemler gereklidir.
Burada, rezeke edilmiş SBNET'lerin kullanılabilirliğinden yararlanıyoruz ve ecm'de büyüyen spheroidler olarak bu hasta kaynaklı SBNET'leri kültüre almanın bir yolunu oluşturduk. Bu makalenin genel amacı, SBNET'in immünororesans boyama ve immünohistokimya ile SBNET belirteçlerinin tutulması için bu küresel leri karakterize etmek için üç boyutlu (3D) bir kültür ve anahat prosedürleri olarak kültüre yönelik bir yöntemi tanımlamaktır.
Buna ek olarak, bu SBNET spheroids rapamycin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek, NETs için bir anti-kanser ilaç8. Bu protokolün arkasındaki mantık, SBNET hücrelerini in vitro olarak büyütmek ve bunları uyuşturucu testi için kullanmak için yeni bir yöntem geliştirmektir. Bu tekniğin geleneksel SBNET hücre hattı oluşturma yöntemine göre avantajı, SBNET'lerin 3Boyutlu kültürlerinin hızla elde edilebiliyor olması ve ilaç testinin 3 hafta içinde yapAbildiğidir. SBNET spheroids potansiyel SBNET hastalar için yeni ilaçlar belirlemek için in vitro ilaç ekranları gerçekleştirmek için bir model olarak kullanılabilir. SBNET hücre hatları yaygın olarak mevcut olmadığından, SBNET spheroids 3D kültürleri SBNETs eğitimi için yeni bir in vitro model olarak hizmet verebilir ve alanında bilim adamları arasında paylaşılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1009px;" width="1009">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Anti-rabbit FITC</td>
			<td style="width:196px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">11-095-152</td>
			<td style="width:437px;">Secondary antibody couple to a green fluorophore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2367</td>
			<td>Solution at pH 9 for preparing slides for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autostainer Link 48</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system for antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Container to for freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">CellSence</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.18</td>
			<td>Computer software for using fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody</td>
			<td>Abcam-45179</td>
			<td style="width:119px;">RB-9003-PO</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromogranin A antibody (clone LK2H10)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-13096</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0130</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Medium for tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>Medium for organoid cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Solvent for dissolving drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td>Enzyme for digesting tumor tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium Homodimer</td>
			<td style="width:196px;">Chemodex</td>
			<td style="width:119px;">CDX-E0012-T1E</td>
			<td>DNA and RNA binding dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX35</td>
			<td>Microscope for taking pictures of SBENT spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A2916801</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;">Version 1.51</td>
			<td>Computer software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0516</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td style="width:196px;">Corning</td>
			<td>356235</td>
			<td>Matrix to embed and anchore organoids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium (VECTASHIELD)</td>
			<td style="width:196px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Fixative for labelled-cells with a nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>Reagent to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEN/STREP</td>
			<td style="width:196px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>Reagent for culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PT Link</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Automated system to prepare slides for IHC staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapamycin</td>
			<td style="width:196px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J62473</td>
			<td>Drug that can inhibit NET growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Secondary antibodies for IHC</td>
			<td style="width:196px;">Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">K8000</td>
			<td>Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody</td>
			<td style="width:196px;">GeneScritp</td>
			<td style="width:119px;">A01591</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSTR2 antibody (clone UMB1)</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>ab134152</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody</td>
			<td style="width:196px;">Abcam</td>
			<td>32127</td>
			<td>Antibodies for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7315</td>
			<td>Antibodies for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonX</td>
			<td style="width:196px;">Mallinckrodt</td>
			<td style="width:119px;">3555 KBGE</td>
			<td>Reagent to permeablize cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Y-2763 ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Adipogen</td>
			<td style="width:119px;">AG-CR1-3564-M005</td>
			<td>To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of small bowel neuroendocrine tumor spheroids

İnce barsak nöroendokrin tümörleri (SBNETs) bağırsak enterokromafin hücrelerinden kaynaklanan nadir kanserlerdir. Çok az hasta sbnet hücre hatları üretilmiştir çünkü bu alanda araştırma sınırlı olmuştur. İyi diferansiye SBNET hücreleri yavaş büyür ve yayılması zordur. Kurulan birkaç hücre satırı kolayca kullanılamaz ve kültürde zaman sonra NET hücrelerinin özelliklerini ifade etmeye devam etmeyebilir. SBNET hücrelerinin uzun bir katlama süresine sahip olması ve kanserle ilişkili fibroblastların hızla bölünmesini ortadan kaldırmak için birçok zenginleştirme adımı na ihtiyaç duyulduğundan, yeni hücre hatlarının üretilmesi uzun yıllar sürebilir. Bu sınırlamaları aşmak için, sbnet hücrelerini cerrahi olarak çıkarılan tümörlerden hücre dışı matrikste (ECM) küresel oidler olarak kültüre getirmek için bir protokol geliştirdik. ECM, SBNET hücrelerini kapsülleyen ve SBNET hücrelerinin büyümesine izin verdiği için tümör mikro ortamını taklit eden 3 boyutlu bir matris oluşturur. Burada SBNET spheroidlerinin büyüme hızını karakterize ettik ve sfheroidlerin nöroendokrin tümör hücreleri olduğunu doğrulamak için immünoreskan mikroskobu ve immünohistokimya kullanarak SBNET belirteçlerini tanımlamak için kullanılan yöntemleri tanımladık. Buna ek olarak, rapamisin sitotoksisitesini test etmek için SBNET spheroids kullanılır.

Şu anda sadece 2 SBNET hücre hatları kurulmuş veyayınlanan 2,3,4,5 ve birçok araştırmacı için hazır değildir. Burada, ECM'de spheroids olarak Kültür SBNET önermek ve SBNET ilaç duyarlılığı çalışma için alternatif bir model olarak kullanabilirsiniz. Karaciğere metastaz yapan bir SBNET'ten elde edilen hasta kaynaklı tümör toplandı, SBNET hücrelerini serbest bırakmak...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids at JoVE.com

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Nöroendokrin tümörler (NeTs) nöral ibik nöroendokrin hücrelerden kaynaklanır. Onlar yavaş büyüyen ve kültüre meydan okuyor. Biz küresel olarak onları culturing tarafından ince bağırsak tan NETs büyümek için alternatif bir strateji salıyoruz. Bu spheroids ince barsak NET belirteçleri var ve ilaç testi için kullanılabilir.

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

İyi diferansiye SBNET hücreleri yavaş büyür ve yayılması zordur. Birkaç kurulan hücre hatları araştırmacılar için hazır değildir. Bu sınırlamaları aşmak için bu 3D kültür protokolünü geliştirdik.Bu tekniğin geleneksel SBNET hücre hattı oluşturma yöntemine göre avantajı, 3D kültürlerin elde edilebiliyor olması ve üç hafta içinde uyuşturucu testinin yapılabildiğidir. Bu yöntem pankreas nöroendokrin tümörler gibi diğer nöroendokrin tümörler için uygulanabilir. Rezeke edilmiş bir hasta SBNET numunesi aldıktan sonra, beş milimetre küp ler halinde kesin ve 25 mililitre DMEM F12 ortamı içinde taşıma için konik bir tüpte saklayın.El yazması talimatlara göre hazırlanan yıkama ortamında tümörleri 15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra yeni bir çanak aktarın ve steril kavisli makas kullanarak bir milimetreden daha az parçalar alavurun. Kıymalı dokuları 25 mililitre yıkama ortamı içeren yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın, ardından numuneyi 500 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Supernatant atın ve kollajenaz ve DNase ile yıkama orta 10 mililitre pelet resuspend. 90 dakika boyunca yavaş sallayarak kıyma tümörleri 37 santigrat derecede sindirimi için izin verin. Tümör örneklerini fazla sindirmemek önemlidir.Çok fazla enzim veya daha uzun kuluçka süresi SBNET hücrelerini öldürür. Sindirim tamamlandıktan sonra, 4 santigrat derece 15 dakika boyunca 500 kez g tüp santrifüj. Supernatant atın ve yıkama orta 15 mililitre pelet resuspend.Yeni bir 50 mililitrelik tüpün üzerine 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirin ve 10 mililitre yıkama tamponunu süzgeçten geçirin. Hücrelerin yanlara yapışmasını önlemek için tüpün içindeki yıkama tamponu girdap. Daha sonra süzgeç aracılığıyla hücre süspansiyon filtre.Hücreleri 500 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant atın ve yıkama orta 200 mikrolitre pelet resuspend. Tüpü buza yerleştirin ve hemositometre ile hücre sayma için hücrelerin beş mikrolitrekullanın.Hücre sayısını hesaplayın, sonra süpernatant kaldırmak ve mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu sıvı ECM hücreleri yeniden askıya santrifüj tekrarlayın. Daha sonra, ECM'deki 5 ila 20 mikrolitre SBNET küresellitresini 96 kuyu plakasına aktarın ve sıvı ECM'nin katılaşabilmesi için plakayı 37 derece lik antiktürde bir kuluçka makinesine yerleştirin. Daha önce açıklandığı gibi kök hücre medyasında organoidler spheroids veya kültür içeren her kuyuya SBNET kültür ortamı 200 mikrolitre ekleyin.Bir P1000 pipet bir 1.5 mililitre tüp organoidler aktarmak ve supernatant kaldırmak için bir dakika için 1, 500 kez g tüp santrifüj kullanın. Supernatant kaldırmak için tekrar PBS ve santrifüj bir mililitre ile kültür yıkayın. Daha sonra 500 mikrolitre paraformaldehit ekleyerek ve 15 dakika kuluçkaya yatarak organoidleri düzeltin.Kuluçkadan sonra, kültürü bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Kültürü permeabilize etmek için %3 BSA ve %0,1 Triton X-100 ile 500 mikrolitre PBS ekleyin. Tüpü beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra organoidleri bir mililitre PBS ve %3 BSA ile üç kez yıkayın.Daha sonra, bir saat boyunca birincil antikorlar ile kültür kuluçka sonra PBS ve BSA ile yıkıntıtekrar. Sekonder antikorlarla kuluçkaya yatın ve tüm supernatant'ı aspire edip atmayı unutmayın. Küresel leri görüntülemek için, DAPI içeren beş mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve beş mikrolitre küresel mikrolitreyi cam bir slayta aktarmak için P20 pipetkullanın.10, 20 ve 40X hedeflerini kullanarak slaytı bir kapak ve görüntü yle floresan mikroskopla kapatın. Mekanik bir P1000 pipet ile ECM kırmak ve steril bir 1.5 mililitretüp aktarın. Tüpü 1,000 kez 4 santigrat derecede santrifüj edin.Sonra tüm supernatant çıkarın ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Peletyeni ECM hacminin 2-4 katını ekleyin ve hava kabarcıklarının ortaya çıkmaması için 10 kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak tüpün içeriğini karıştırın. ECM ve SBNET karışımının 5 ila 20 mikrolitresini yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin.Daha sonra katılaşmış ECM'yi yeni SBNET ortamıyla kaplayın ve plakayı kuvöze koyun. SBNET küreselleri başka bir laboratuvara gönderiyorsanız, yeni ECM'li küresel leri Bir T25 şişesine aktarın ve ECM'nin katılaşmasını bekleyin. Şişeyi SBNET küresel orta ile doldurun, kapağı sıkıca vidalayın ve sevkiyat paketini hazırlayın.Küresel kültürü aldıktan sonra, kültür ortamını kaldırın ve küreselleri kültüre geri koymak için önceki adımları tekrarlayın. Mikroskobik görüntüleme ile SBNET küresel büyüme hızı izlendi. SBNET küresellerinin kültür ortamı haftada bir kez değiştiğinde iki katına çıkarmaları yaklaşık 14 gün sürer.Kültürde 14 gün sonra, SBNET spheroids boyutu artmaz. Sferoidler sinaptophysin, kromogranin A ve SSTR2'ye özgü antikorlarla boyandı ve immünoforesan mikroskopi ile görüntülendi. Veriler bu belirteçlerin sitoplazmada ve SBNET hücrelerinin zarında lokalize olduğunu göstermiştir.Antikorların özgüllüğünü sağlamak için, sinaptofirin, kromogranin A ve SSTR2'yi ifade etmeyen pankreas tümöründen organoid bir çizgi üzerinde aynı boyama işlemleri yapıldı ve yeşil sinyal saptanmadı. İmmünofloresan görüntülemenin en büyük avantajı dört saat içinde yapAbilmekte ve immünohistokimyagibi benzer boyama bilgileri verebilmektir. SBNET'in küresel olarak kültüre edilmesi, SBNET büyümesini engelleyen ilaçların tanımlanması nda kullanılan değerli bir tekniktir.Spheroidler rapamisin ve mTOR inhibitörü ile tedavi edildi. Beş gün sonra, rapamisin tedavi küresel bir üzüm benzeri bir yapı kurdu ve apoptotik veya nekrotik oldu. Bu prosedürü denerken, hücre süzgeci ve toplama tüpünü yıkama ortamı ile önceden ıslamak önemlidir.Bu, SBNET hücrelerinin hücre süzgecine ve plastik tüpe yapışmasını önler. Bu protokol ile bilim adamları ve klinisyenler rezeke tümörlerden SBNET küresel kültürleri kurabilir, diğer laboratuvarlarla paylaşabilir ve FDA onaylı ilaçları test etmek için kullanabilirler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Operating Procedures of the Electrochemotherapy for Treatment of Tumor in Dogs and Cats

Köpek ve Kedilerde Tümör Tedavisinde Elektrokemoterapi İşletim Prosedürleri

Electrochemotherapy (ECT) is a local approach which is used for treating solid tumors of different histologies. Its mechanism is based on cell membrane ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tümör Sferoidlerinin Yarı Yüksek Verimli Analizi için Hızlı Optik Temizleme

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

3D Çok Hücreli Akciğer Tümörü Sferoidlerinden İzole Edilen Kanserle İlişkili Fibroblastlarda Mitokondriyal Sağlığın Değerlendirilmesi

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...