Name: glomerular outgrowth as an ex vivo assay to analyze pathways involved in parietal epithelial cell activation
Uploaded: 2020-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door Dutch Kidney Foundation (subsidie 14A3D104) en NWO VIDI subsidie: 016.156.363).

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Commissie Dierethiek van de Radboud Universiteit Nijmegen.
OPMERKING: Onbehandelde, gezonde wilde type (WT) muizen (n = 4) en cd44-/- (n = 4) muizen werden geofferd op de leeftijd van 12−16 weken. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt. Alle muizen waren op de C57Bl/6 achtergrond.
1. Muis nierdissectie
<ol><li>Offer gezonde WT muizen of genetisch veranderde muizen door cer...

<ol>
	<li>Fatima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cell+activation+marker+in+early+recurrence+of+FSGS+in+the+transplant.">Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant.</a> Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).</li><li>Dijkman, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+cells+in+HIV+and+pamidronate-associated+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis+are+parietal+epithelial+cells.">Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.</a> Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).</li><li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+histological+patterns+in+glomerular+epithelial+cells+in+secondary+focal+segmental+glomerulosclerosis.">Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).</li><li>Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parietal+epithelial+cell+is+crucially+involved+in+human+idiopathic+focal+segmental+glomerulosclerosis.">The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cells+participate+in+the+formation+of+sclerotic+lesions+in+focal+segmental+glomerulosclerosis.">Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+origin+of+glomerular+extracapillary+lesions+from+parietal+epithelial+cells.">Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).</li><li>Smeets, B., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cells+and+podocytes+in+glomerular+diseases.">Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases.</a> Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).</li><li>Ryu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+leakage+through+glomerular+basement+membrane+ruptures+triggers+the+proliferation+of+parietal+epithelial+cells+and+crescent+formation+in+non-inflammatory+glomerular+injury.">Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury.</a> The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).</li><li>Eymael, J., Smeets, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+fate+of+the+regenerating+cells+of+the+kidney.">Origin and fate of the regenerating cells of the kidney.</a> European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+progenitor+cells+contribute+to+hyperplastic+lesions+of+podocytopathies+and+crescentic+glomerulonephritis.">Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).</li><li>Eymael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+is+required+for+the+pathogenesis+of+experimental+crescentic+glomerulonephritis+and+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis.">CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).</li><li>Roeder, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ERK1/2+increases+CD44+in+glomerular+parietal+epithelial+cells+leading+to+matrix+expansion.">Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion.</a> Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).</li><li>Appel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+podocytes+from+glomerular+parietal+epithelial+cells.">Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).</li><li>Yaoita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+epithelial+cells+in+rat+glomerular+cell+culture.">Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture.</a> European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).</li><li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+Glucocorticoid+Action+in+GN.">Investigations of Glucocorticoid Action in GN.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li></ol>

Met behulp van het protocol beschreven in dit artikel, kan men gebruik maken van enkele ingekapselde glomeruli te evalueren pariëtale epitheelcelproliferatie die een gevolg is van pariëtale epitheelcel activering. Dit ex vivo model zal ons in staat stellen om in detail te bestuderen van de moleculaire trajecten, die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcel activering. De beschreven methode is gebaseerd op het eenvoudige concept van nierdissectie en zeven om glomeruli te isoleren en te kweken en te vergelijken en proli...

Glomerulaire ziekten zijn een belangrijke groep nieraandoeningen en vormen een belangrijke oorzaak van nierziekten in het eindstadium (ESRD). Helaas zijn specifieke behandelingsopties beperkt en is progressie naar ESRD onvermijdelijk. Glomerulaire ziekten worden gedefinieerd door de aanwezigheid van glomerulair letsel en kunnen worden gegroepeerd bij ontstekings- en niet-ontstekingsziekten. Hoewel de eerste belediging anders is, hebben recente studies aangetoond dat een gemeenschappelijk cellulair mechanisme leidt tot glomerulaire epitheliale celhyperplasie en uiteindelijk tot glomerulosclerose bij alle glomerulaire ziekten, ongeacht de onderliggende oorzaak1,2,3,4.
Concreet werd aangetoond dat glomermerosclerotische laesies voornamelijk bestaan uit geactiveerde pariëtale epitheelcellen5,6. Onder fysiologische omstandigheden zijn pariëtale epitheelcellen platte rustige epitheliale cellen die de Bowman's capsule van de glomerulus belijnen. Echter, elke glomerulaire schade als gevolg van genetische mutaties (bijvoorbeeld podocyte specifieke of mitochondriale cytopathieën), ontsteking of hyperfiltratie (bijvoorbeeld veroorzaakt door verminderde niermassa, hypertensie, obesitas of diabetische mellitus) kan leiden tot de activering van pariëtale epitheelcellen. Geactiveerde pariëtale epitheelcellen vermenigvuldigen en deponeren extracellulaire matrix wat resulteert in de vorming van cellulaire halve maan of sclerotische laesies5,7,8. Progressie van deze processen resulteert in verlies van nierfunctie9. Daarom is pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke factor in de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose bij zowel ontstekings- als niet-inflammatoire glomerulare ziekten1,2,3,4,10.
De moleculaire processen die pariëtale epitheelcelactivering bemiddelen zijn nog grotendeels onbekend. Recente studies tonen aan dat geactiveerde pariëtale epitheelcellen de novo express CD44, een receptor die belangrijk is voor de activering van verschillende trajecten die betrokken zijn bij cellulaire proliferatie en migratie. Bovendien bleek dat remming van CD44 pariëtale epitheelcelactivering remt en de progressie van halve maanvorming en glomermerorose in diermodellen van ontstekings- en niet-inflammatoire glomerrale ziekten11,12.
Aangezien pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke speler is voor de ontwikkeling van glomerulosclerose en halve maanvorming, kan remming van deze cellen de progressie van glomerulaire ziekten vertragen. Opheldering van de moleculaire paden die pariëtale epitheelcelactivering stimuleren, kan leiden tot de ontwikkeling van specifieke therapeutische interventies die de vorming van de hyperplastische en glomerolosclerotische laesies bij glomerrale ziekte verzachten.
In experimentele diermodellen is het vaak moeilijk om bewijs te leveren voor een direct effect van een veranderde genexpressie (knock-outmodellen of transgene muismodellen) of medicamenteuze behandeling op de pariëtale epitheelcellen. Bij een conventionele knock-outmuis kunnen de waargenomen in vivo veranderingen worden verklaard door directe veranderingen in pariëtale epitheelcellen. Aangezien de genexpressie echter ook in andere celtypen binnen de muis wordt gewijzigd, kan men indirecte effecten die door andere celtypen worden bemiddeld, niet uitsluiten. De ontwikkeling van voorwaardelijke cre-lox muizen gedreven door promotors voornamelijk actief in pariëtale epitheelcellen heeft een oplossing in sommige gevallen13. Niettemin zijn voorwaardelijke transgene modellen complex en hoewel er meer voorwaardelijke lijnen beschikbaar komen, is er voor veel van de conventionele knock-out- of transgene muislijnen nog geen voorwaardelijk substituut.
Om de directe effecten op pariëtale epitheelcellen te bestuderen, heeft onze groep een ex vivo test ontwikkeld met behulp van enkele ingekapselde glomeruli geïsoleerd van muizennieren om pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie te meten en te analyseren. Deze methode zal ons in staat stellen om pariëtale epitheelcelspecifieke effecten te bepalen en verantwoordelijke trajecten te vinden voor pariëtale epitheelcelactivering en testbehandelingsopties om deze activering te remmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >24-well cell culture plate</td>
			<td >Corning Costar</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Endothelial cell marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken-anti-rat Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI-Fluoromount G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Mounting medium containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital inverted light microscope</td>
			<td>Westburg, EVOS fl microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >donkey-anti-goat Alexa 568</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >donkey-anti-rabbit Alexa 568</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM-MV Single Quots kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Calf Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat-anti-synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Podocyte marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39;Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td >FIJI 1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >petri dish</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td>size 100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rabbit-anti-claudin1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rabbit-anti-SSeCKS</td>
			<td>Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA</td>
			<td>kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rat-anti-CD44</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel</td>
			<td >Dahlhausen</td>
			<td>size 10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sieves&#160;</td>
			<td >Endecotts Ltd</td>
			<td>size 300 &#181;m, 75 &#181;m, 53 &#181;m, steel</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe</td>
			<td >BD Plastipak</td>
			<td>size: 20 ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra-Low Attachment Microplates&#160;</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>6-well plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glomerular outgrowth as an ex vivo assay to analyze pathways involved in parietal epithelial cell activation

Pariëtale epitheelcel (PEC) activering is een van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose. Remming van trajecten die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelactivering kan daarom een hulpmiddel zijn om de progressie van glomerulaire ziekten te verzachten. Dit artikel beschrijft een methode om te cultuur en analyseren pariëtale epitheelcel uitgroei van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Na het ontleden van geïsoleerde muizennieren wordt het weefsel gehakt en glomeruli geïsoleerd door te zeven. Ingekapselde glomeruli worden verzameld, en enkele glomeruli worden gekweekt voor 6 dagen tot glomerulaire uitgroei van pariëtale epitheelcellen te verkrijgen. Tijdens deze periode kunnen pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie worden geanalyseerd door het celgetal of het oppervlak van ontgroeiende cellen te bepalen. Deze test kan daarom worden gebruikt als een instrument om de effecten van een veranderde genexpressie bij transgene- of knock-outmuizen of de effecten van cultuuromstandigheden op pariëtale epitheelcelgroeikenmerken en signalering te bestuderen. Met behulp van deze methode kunnen belangrijke trajecten worden bestudeerd die betrokken zijn bij het proces van pariëtale epitheliale celactivering en bijgevolg bij glomerulosclerose.

Een systematisch diagram van de methode om de glomerulaire uitgroeitest uit te voeren wordt weergegeven in figuur 1. Figuur 2A-D toont glomerulaire uitwassen van ingekapselde glomeruli op verschillende tijdstippen zoals waargenomen met behulp van lichte microscopie. Uitwassen worden op dag 2, 4 en 6(figuur 2B-D)in de cultuur weergegeven na glomerulus isolatie van de ...

Watch this Scientific Journal Video about Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation at JoVE.com

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Dit artikel beschrijft een methode voor het kweken en analyseren van glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Deze methode kan worden gebruikt om trajecten te bestuderen die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie.

Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Activering van pariëtale epitheelcellen is een belangrijke factor in de ontwikkeling van littekenweefsel in de glomerulus van de nier. Met behulp van deze methode kunnen we de cellulaire processen bestuderen die betrokken zijn bij deze activering en hopelijk behandelopties vinden om de progressie van de ziekte te vertragen of zelfs te stoppen. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat we primaire cellen gebruiken die rechtstreeks uit de geïsoleerde glomeruli groeien.Na het bevrijden van de nieren, zoals beschreven in de tekst manuscript, houd de nier met de chirurgische tangen en gebruik een ander paar tangen te trekken uit de nier capsules. Plaats hierna de nieren in de putten van een zesputcultuurplaat die elk twee milliliter HBSS bevat en plaats de kweekplaat op ijs. Breng eerst de nieren over op een petrischaaltje van 100 millimeter en gebruik twee scalpels om ze in kleine stukjes te hakken die ongeveer één tot twee millimeter zijn.Houd de gehakte nierstukken nat met HBSS. Plaats vervolgens de nierstukken bovenop een metalen zeef van 300 micrometer en druk de nier door de zeef met behulp van de zuiger van een spuit van 20 milliliter. Spoel de zeef herhaaldelijk met HBSS ertussen en gebruik een serologische pipet om de doorstroom te verzamelen en over te brengen naar een schone petrischaal.Gebruik een scalpel om alles wat overblijft in de bodem van de zeef af te schrapen en over te dragen aan het verzamelde nierhomogenaat. Spoel het nierhomogenaat door een zeef van 75 en 53 micrometer met HBSS. Was vervolgens beide zeven met HBSS om alle kleinere structuren te verwijderen.Verzamel de nierstructuren en het materiaal dat in de zeven bleef door het bovenste oppervlak van elk met DMEM te wassen aangevuld met 20% foetale kalfserum en breng het materiaal over naar de putten van een zes goed ultra-lage bevestigingsmicroplaat. Breng de ultra-lage bevestiging microplate naar een omgekeerde lichtmicroscoop en gebruik een 20 microliter pipet nam verzamelen enkele ingekapseld en of decapsulated glomeruli. Na het vangen van een enkele glomerulus in de pipetpunt, voeg verse DMEM medium zonder verzameld niermateriaal in dezelfde pipetpunt aan een volume van 20 microliters.Breng de enkele glomerulus met het DMEM-medium naar het midden van een put van een 24 goed celkweekplaat en broeder bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende drie uur om de bevestiging van de glomerulus aan het midden van de put mogelijk te maken. Na de incubatie wordt de glomerulus aan het midden van de put bevestigd. Voeg voorzichtig 500 microliters endotheel Basaal medium toe aangevuld met een groeifactorkit en nog eens 5%FBS en 1%penicilline en streptomycine aan elke put.Kweek de enkele glomeruli op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende zes dagen. Gebruik na zes dagen incubatie een digitale omgekeerde lichtmicroscoop om foto's te maken en de glomerulaire uitgroei te analyseren. Bepaal met behulp van een software voor beeldanalyse het oppervlak van de glomerulaire uitgroei door een van de afbeeldingsbestanden te openen met een schaalbalk.Teken een rechte lijn op de schaalbalk en klik op Analyseren en meet vervolgens om de afstand in pixels te bepalen. Als u de schaal wilt bepalen, klikt u op Schaal analyseren en instellen en voert u de bekende afstand in pixels, de bekende afstand en de lengte-eenheid in. Klik op Ok als u klaar bent.Klik op Analyseren en Metingen instellen. Controleer vervolgens de opties voor Gebied en Weergavelabel. Klik op Ok als u klaar bent.Vervolgens trekt een vrije hand selectie rond de glomerular uitgroei. Klik op Analyseren en meten om een resultatentabel weer te geven, die het oppervlak van uitgroei in de eerder bepaalde schaal bevat. in deze studie worden de glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van muizennieren, gekweekt en geanalyseerd.Representatieve lichtmicroscopie beelden tonen de glomerulaire uitwassen op verschillende tijdstippen tijdens de cultuur na de glomerulus zijn geïsoleerd van de muis nieren. Om te valideren dat de ontgroeiende cellen pariëtale epitheelcellen zijn, worden de uitgesloten glomeruli ook gedurende zes dagen geïsoleerd en gekweekt. Gedecapsuleerde glomeruli vertonen geen celuitgroei tijdens deze incubatietijd.Immunofluorescente kleuring wordt vervolgens uitgevoerd voor verschillende pariëtale epitheelcelmarkers, fotosite specifieke markers, evenals endotheelcelmarkeringen. De resultaten valideren dat de ontgroeiende cellen inderdaad pariëtale epitheelcellen zijn. Glomeruli geassocieerd met CD44 knock-out muizen tonen een verminderd aantal uitgroeiende cellen, evenals een verminderd oppervlak van glomerulaire uitgroei in vergelijking met de glomeruli geïsoleerd van wilde type muizen.Dit suggereert een belangrijke rol voor CD44 in pariëtale epitheelcelactivering. Met behulp van deze techniek is het ook mogelijk om de effecten op geneesmiddelen op pariëtale epitheelcelactivering te bestuderen. Dit kan worden gedaan door de behandeling van de geïsoleerde glomeruli met het medicijn van uw keuze en om de verschillen in celgroei en celmigratie te analyseren.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analyse van Metabool profiel in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...