Name: glomerular outgrowth as an ex vivo assay to analyze pathways involved in parietal epithelial cell activation
Uploaded: 2020-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation at JoVE.com

इस शोध को डच किडनी फाउंडेशन (ग्रांट 14A3D104) और नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ विडी ग्रांट: 016.156.363) द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी पशु प्रयोग राबोड विश्वविद्यालय निजमेगेन की पशु आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार किए गए ।
नोट: अनुपचारित, स्वस्थ जंगली प्रकार (WT) चूहों (n = 4) और cd44-/-(n = 4) चूहों 12−16 सप्ताह की उम्र में बलि?...

<ol>
	<li>Fatima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cell+activation+marker+in+early+recurrence+of+FSGS+in+the+transplant.">Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant.</a> Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).</li><li>Dijkman, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+cells+in+HIV+and+pamidronate-associated+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis+are+parietal+epithelial+cells.">Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.</a> Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).</li><li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+histological+patterns+in+glomerular+epithelial+cells+in+secondary+focal+segmental+glomerulosclerosis.">Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).</li><li>Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parietal+epithelial+cell+is+crucially+involved+in+human+idiopathic+focal+segmental+glomerulosclerosis.">The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cells+participate+in+the+formation+of+sclerotic+lesions+in+focal+segmental+glomerulosclerosis.">Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+origin+of+glomerular+extracapillary+lesions+from+parietal+epithelial+cells.">Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).</li><li>Smeets, B., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cells+and+podocytes+in+glomerular+diseases.">Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases.</a> Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).</li><li>Ryu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+leakage+through+glomerular+basement+membrane+ruptures+triggers+the+proliferation+of+parietal+epithelial+cells+and+crescent+formation+in+non-inflammatory+glomerular+injury.">Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury.</a> The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).</li><li>Eymael, J., Smeets, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+fate+of+the+regenerating+cells+of+the+kidney.">Origin and fate of the regenerating cells of the kidney.</a> European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+progenitor+cells+contribute+to+hyperplastic+lesions+of+podocytopathies+and+crescentic+glomerulonephritis.">Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).</li><li>Eymael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+is+required+for+the+pathogenesis+of+experimental+crescentic+glomerulonephritis+and+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis.">CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).</li><li>Roeder, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ERK1/2+increases+CD44+in+glomerular+parietal+epithelial+cells+leading+to+matrix+expansion.">Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion.</a> Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).</li><li>Appel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+podocytes+from+glomerular+parietal+epithelial+cells.">Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).</li><li>Yaoita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+epithelial+cells+in+rat+glomerular+cell+culture.">Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture.</a> European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).</li><li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+Glucocorticoid+Action+in+GN.">Investigations of Glucocorticoid Action in GN.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li></ol>

इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोई भी पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए एकल एनक्सुलेटेड ग्लोमेरुली का उपयोग कर सकता है जो पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण का परिणाम है। य?...

ग्लोमेरुलर रोग गुर्दे के विकारों का एक महत्वपूर्ण समूह हैं और अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ईएसआरडी) का एक प्रमुख कारण प्रतिनिधित्व करते हैं। दुर्भाग्य से, विशिष्ट उपचार विकल्प सीमित हैं और ईएसआरडी के लिए प्रगति अपरिहार्य है। ग्लोमेरुलर रोगों को ग्लोमेरुलर चोट की उपस्थिति से परिभाषित किया जाता है और भड़काऊ और गैर-भड़काऊ बीमारियों में समूहित किया जा सकता है। यद्यपि प्रारंभिक अपमान अलग है, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक सामान्य सेलुलर तंत्र ग्लोमेरुलर एपिथेलियल सेल हाइपरप्लासिया की ओर जाता है और अंततः सभी ग्लोमेरुलरस्लोरोसिस में ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस की ओर जाता है, चाहे अंतर्निहित कारण1,,2,,3,,4हो।
विशेष रूप से, यह दिखाया गया था कि ग्लोमेरुलोस्क्लेरोटिक घाव मुख्य रूप से सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं5,,6से बने होते हैं। शारीरिक परिस्थितियों में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं सपाट शांत एपिथेलियल कोशिकाएं होती हैं जो ग्लोमेरुलस के बोमन कैप्सूल को लाइन करती हैं। हालांकि, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों (जैसे, पोडोकोन्ड्रियल साइटोपैथी), सूजन या हाइपरफिल्ट्रेशन (उदाहरण के लिए, कम गुर्दे के द्रव्यमान, उच्च रक्तचाप, मोटापा या मधुमेह मेलिटस के कारण) के कारण किसी भी ग्लोमेरुलर चोट पैरिटल एपिथेलियल कोशिकाओं की सक्रियता को ट्रिगर कर सकती है। सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं जन्म देती हैं और बाह्य कोशिकाओं को जमा करती हैं जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर वर्धमान या स्क्लेरोटिक घाव5,7,8होते हैं ।8 इन प्रक्रियाओं की प्रगति के परिणामस्वरूप गुर्दे के कार्य9की हानि होती है । इसलिए, पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन भड़काऊ और गैर-भड़काऊ ग्लोमेरुलरस्लोरुलरसिवसैस दोनों में ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस के विकास और प्रगति में एक महत्वपूर्ण कारक है1,2,,3,,4,,10.
आणविक प्रक्रियाएं मध्यस्थता पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं de novo एक्सप्रेस CD44, एक रिसेप्टर है कि सेलुलर प्रसार और प्रवास में शामिल विभिन्न रास्तों की सक्रियता के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सीडी 44 के अवरोध को पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण को बाधित करने और भड़काऊ के साथ-साथ गैर-भड़काऊ ग्लोमेरुलर रोगों के पशु मॉडलों में वर्धमानगठन,और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस की प्रगति को कम करने के लिए दिखाया गयाथा।
चूंकि पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस और वर्धमान गठन के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है, इन कोशिकाओं का अवरोध ग्लोमेरुलर रोगों की प्रगति को धीमा कर सकता है। पैराइटल एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन को चलाने वाले आणविक रास्तों की स्पष्टता से विशिष्ट चिकित्सीय हस्तक्षेपों का विकास हो सकता है जो ग्लोमरुलर रोग में हाइपरप्लास्टिक और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोटिक घावों के गठन को कम करते हैं।
प्रायोगिक पशु मॉडलों में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर एक परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति (नॉक-आउट मॉडल या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल) या दवा उपचार के प्रत्यक्ष प्रभाव के लिए सबूत प्रदान करना अक्सर मुश्किल होता है। एक पारंपरिक नॉक आउट माउस में वीवो परिवर्तनों में मनाया गया पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में सीधे परिवर्तन ों द्वारा समझाया जा सकता है। हालांकि, चूंकि जीन अभिव्यक्ति को माउस के भीतर अन्य सेल प्रकारों में भी बदल दिया जाता है, इसलिए कोई अन्य कोशिका प्रकारों द्वारा मध्यस्थता किए गए अप्रत्यक्ष प्रभावों को बाहर नहीं कर सकता है। मुख्य रूप से पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में सक्रिय प्रमोटरों द्वारा संचालित सशर्त क्रे-लोक्स चूहों के विकास ने कुछ मामलों में एक समाधान प्रदान किया है13। फिर भी, सशर्त ट्रांसजेनिक मॉडल जटिल हैं और हालांकि अधिक सशर्त लाइनें उपलब्ध हो जाती हैं, पारंपरिक नॉक आउट या ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में से कई के लिए अभी तक सशर्त विकल्प नहीं है।
पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमारे समूह ने पैराशियल एपिथेलियल सेल प्रसार और प्रवासन को मापने और विश्लेषण करने के लिए माउस गुर्दे से अलग एकल समझाया ग्लोमेरुली का उपयोग करके एक पूर्व वीवो परख विकसित की है। यह विधि हमें पार्श्व एपिथेलियल सेल विशिष्ट प्रभावों को निर्धारित करने और इस सक्रियण को बाधित करने के लिए पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण और परीक्षण उपचार विकल्पों के लिए जिम्मेदार रास्ते खोजने में सक्षम करेगी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >24-well cell culture plate</td>
			<td >Corning Costar</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Endothelial cell marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken-anti-rat Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI-Fluoromount G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Mounting medium containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital inverted light microscope</td>
			<td>Westburg, EVOS fl microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >donkey-anti-goat Alexa 568</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >donkey-anti-rabbit Alexa 568</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM-MV Single Quots kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Calf Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat-anti-synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Podocyte marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39;Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td >FIJI 1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >petri dish</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td>size 100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rabbit-anti-claudin1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rabbit-anti-SSeCKS</td>
			<td>Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA</td>
			<td>kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rat-anti-CD44</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel</td>
			<td >Dahlhausen</td>
			<td>size 10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sieves&#160;</td>
			<td >Endecotts Ltd</td>
			<td>size 300 &#181;m, 75 &#181;m, 53 &#181;m, steel</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe</td>
			<td >BD Plastipak</td>
			<td>size: 20 ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra-Low Attachment Microplates&#160;</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>6-well plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glomerular outgrowth as an ex vivo assay to analyze pathways involved in parietal epithelial cell activation

पैराइटल एपिथेलियल सेल (पीईसी) सक्रियण ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस के विकास और प्रगति में शामिल प्रमुख कारकों में से एक है। इसलिए पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में शामिल रास्तों का अवरोध ग्लोमेरुलर रोगों की प्रगति को कम करने के लिए एक उपकरण हो सकता है। यह लेख संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है और माउस गुर्दे से अलग किए गए एनकैप्सुली ग्लोमेरुली के पार्श्व एपिथेलियल सेल वृद्धि का विश्लेषण करता है। अलग माउस गुर्दे विच्छेदन के बाद, ऊतक कीमा बनाया हुआ है, और ग्लोमेरुली को सिविंग द्वारा अलग किया जाता है। एनकैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली एकत्र किए जाते हैं, और एकल ग्लोमेरुली को पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं की ग्लोमेरुलर वृद्धि प्राप्त करने के लिए 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। इस अवधि के दौरान, पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार और माइग्रेशन का विश्लेषण सेल संख्या या आउटग्रोइंग कोशिकाओं के सतह क्षेत्र का निर्धारण करके किया जा सकता है। इसलिए इस परख का उपयोग ट्रांसजेनिक-या नॉकआउट-चूहों में एक परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति के प्रभावों या पार्श्व एपिथेलियल सेल विकास विशेषताओं और सिग्नलिंग पर संस्कृति की स्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण की प्रक्रिया में शामिल महत्वपूर्ण रास्तों और इसके परिणामस्वरूप ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस का अध्ययन किया जा सकता है।

ग्लोमरुलर आउटग्रोथ परख करने की विधि का एक व्यवस्थित आरेख चित्र 1में दिखाया गया है । चित्रा 2ए-डी प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मनाया गया विभिन्न समय बिंद?...

Watch this Scientific Journal Video about Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation at JoVE.com

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

यह लेख माउस गुर्दे से अलग किए गए एनकैप्सुली ग्लोमेरुली के ग्लोमेरुलर पैराइटल एपिथेलियल सेल आउटग्रोथ का विश्लेषण करने और विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार और माइग्रेशन में शामिल रास्तों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

पैराइटल एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन में शामिल रास्तों का विश्लेषण करने के लिए एक पूर्व वीवो परख के रूप में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

पैरीटल एपिथेलियल कोशिकाओं की सक्रियता गुर्दे के ग्लोमेरुलस में निशान ऊतक के विकास में महत्वपूर्ण कारक है। इस विधि का उपयोग करके, हम इस सक्रियण में शामिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन कर सकते हैं और उम्मीद है कि रोग प्रगति को धीमा करने या यहां तक कि रोकने के लिए उपचार विकल्प मिल सकते हैं। हमारी तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि हम प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो सीधे अलग ग्लोमेरुली से बढ़ते हैं।गुर्दे को मुक्त करने के बाद, जैसा कि पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित है, गुर्दे को सर्जिकल संदंश के साथ पकड़ें और गुर्दे के कैप्सूल को खींचने के लिए एक और जोड़ी संदंश का उपयोग करें। इसके बाद, गुर्दे को छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के कुओं में रखें कि प्रत्येक में एचबीबीएस के दो मिलीलीटर होते हैं और संस्कृति प्लेट को बर्फ पर रखते हैं। सबसे पहले, गुर्दे को 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें छोटे टुकड़ों में कीमा बनाने के लिए दो स्केलपेल का उपयोग करें जो लगभग एक से दो मिलीमीटर हैं।कीमा वेज किडनी के टुकड़ों को एचबीएसएस से गीला रखें। इसके बाद, गुर्दे के टुकड़ों को 300 माइक्रोमीटर धातु छलनी के शीर्ष पर रखें और 20 मिलीलीटर सिरिंज से प्लंजर का उपयोग करके छलनी के माध्यम से गुर्दे को दबाएं। बार-बार बीच में एचबीबीएस के साथ छलनी कुल्ला और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने और इसे एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।छलनी के तल में रहने वाली हर चीज को कुरेदने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें और इसे एकत्र गुर्दे के समरूप में स्थानांतरित करें। एचबीएसएस के साथ 75 और 53 माइक्रोमीटर छलनी के जरिए किडनी को समरूप ी करें। फिर, सभी छोटी संरचनाओं को हटाने के लिए एचबीबीएस के साथ दोनों छलनी धोएं।गुर्दे की संरचनाओं और सामग्री है कि DMEM के साथ प्रत्येक की ऊपरी सतह धोने के द्वारा छलनी में बने 20% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक और एक छह अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव माइक्रोप्लेट के कुओं के लिए सामग्री हस्तांतरण ले लीजिए । अल्ट्रा-कम अटैचमेंट माइक्रोप्लेट को एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप में लाएं और 20 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें एकल समझाया और या decapsulated glomeruli इकट्ठा किया । पिपेट टिप में एक भी ग्लोमेरुलस पकड़ने के बाद, 20 माइक्रोलीटर की मात्रा में एक ही पिपेट टिप में एकत्र गुर्दे की सामग्री के बिना ताजा डीएमईएम माध्यम जोड़ें।डीएमईएम माध्यम के साथ एकल ग्लोमेरुलस को 24 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के कुएं के केंद्र में स्थानांतरित करें और तीन घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि ग्लोबरुलस को कुएं के केंद्र में लगाव की अनुमति दी जा सके। इनक्यूबेशन के बाद, ग्लोमेरुलस कुएं के केंद्र से जुड़ा होगा। ध्यान से एक विकास कारक किट और एक अतिरिक्त 5% FBS और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक एंडोथेलियल बेसल माध्यम के 500 माइक्रोलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें।संस्कृति छह दिनों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एकल glomeruli । छह दिनों के इनक्यूबेशन के बाद, छवियों को लेने और ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ का विश्लेषण करने के लिए एक डिजिटल उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक स्केल बार के साथ छवि फ़ाइलों में से एक को खोलकर चमकदार वृद्धि की सतह क्षेत्र निर्धारित करें।स्केल बार पर एक सीधी रेखा खींचें और विश्लेषण पर क्लिक करें, फिर पिक्सल में दूरी निर्धारित करने के लिए मापें। पैमाने का निर्धारण करने के लिए, विश्लेषण और सेट स्केल पर क्लिक करें और पिक्सल में ज्ञात दूरी, ज्ञात दूरी और लंबाई की इकाई को इनपुट करें। समाप्त होने पर ठीक क्लिक करें।विश्लेषण और माप सेट पर क्लिक करें। इसके बाद एरिया और डिस्प्ले लेबल के विकल्पों की जांच करें। समाप्त होने पर ठीक क्लिक करें।इसके बाद, ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ के चारों ओर एक फ्रीहैंड चयन आकर्षित करें। एक परिणाम तालिका प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण और उपाय पर क्लिक करें, जिसमें पहले निर्धारित पैमाने में वृद्धि का सतह क्षेत्र शामिल है। इस अध्ययन में, एन्कैप्सुलेट ग्लोमेरुली के ग्लोमेरुलर पैराशियल एपिथेलियल सेल आउटग्रोथ माउस गुर्दे, सुसंस्कृत और विश्लेषण से अलग होते हैं।प्रतिनिधि प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां माउस गुर्दे से अलग होने के बाद संस्कृति के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ दिखाती हैं। यह मान्य करने के लिए कि आउटग्रोइंग कोशिकाएं पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं हैं, छह दिनों के लिए अलग-थलग ग्लोमेरुली भी अलग-थलग और सुसंस्कृत हैं। इस इनक्यूबेशन अवधि के दौरान कोई सेल वृद्धि नहीं दिखाती है।इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला तब विभिन्न पार्श्व एपिथेलियल सेल मार्कर, फोटो साइट विशिष्ट मार्कर, साथ ही एंडोथेलियल सेल मार्कर के लिए किया जाता है। परिणाम यह मान्य करते हैं कि आउटग्रोइंग कोशिकाएं, वास्तव में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं हैं। CD44 नॉकआउट चूहों से जुड़े ग्लोमेरुली में आउटग्रोइंग कोशिकाओं की संख्या में कमी दिखाई देती है, साथ ही जंगली प्रकार के चूहों से अलग ग्लोमेरुली की तुलना में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ की सतह की कमी होती है।यह पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में सीडी 44 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देता है। इस तकनीक का उपयोग करके, पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण पर दवाओं पर पड़ने वाले प्रभावों का अध्ययन करना भी संभव है। यह अपनी पसंद की दवा के साथ अलग glomeruli इलाज और सेल विकास और सेल प्रवास में मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

पूर्व प्राथमिक मानव फैलोपियन ट्यूब उपकला कोशिकाओं के Vivo संस्कृति

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis साइटोक्रोम के cytoplasmic Microinjection द्वारा सक्रियकरण ग</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

शाही सेना शोधन द्वारा chromatin अलगाव (कूजन)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

बाल उत्थान के दौरान तेजी से उपकला-mesenchymal संकेतन की आनुवांशिक विश्लेषण

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

एक<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; संस्कृति सिस्टम थायराइड विकास का अध्ययन करने के लिए

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

के लिए माउस भ्रूण पूरे आंत संस्कृति के लिए सिस्टम<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; संकेत दे रास्ते और अंकुर विकास के तीन आयामी लाइव इमेजिंग के हेरफेर

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

में मेटाबोलिक प्रोफ़ाइल के वास्तविक समय विश्लेषण<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; माउस आंतों तहखाना Organoid संस्कृति

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

सी-FOS प्रोटीन Immunohistological जांच: एक उपयोगी उपकरण केंद्रीय रास्ते विशिष्ट शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल की एक मार्कर के रूप में<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; पूर्व विवो</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

इन विट्रो में और Vivo में आंतों उपकला कोशिका पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

एक विधि के रूप में मजबूर लार मच्छरों की वेक्टर क्षमता का विश्लेषण करने के लिए

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...