Name: glomerular outgrowth as an ex vivo assay to analyze pathways involved in parietal epithelial cell activation
Uploaded: 2020-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela Dutch Kidney Foundation (grant 14A3D104) e pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (bolsa NWO VIDI: 016.156.363).

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Universidade Radboud Nijmegen.
NOTA: Ratos selvagens não tratados e saudáveis (TC) (n = 4) e camundongos cd44-/- (n = 4) foram sacrificados aos 12-16 semanas. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas. Todos os ratos estavam no fundo C57Bl/6.
1. Dissecção do rim do rato
<ol><li>Sacrificar camundongos saudáveis ou camundongos geneticamente ...

<ol>
	<li>Fatima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cell+activation+marker+in+early+recurrence+of+FSGS+in+the+transplant.">Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant.</a> Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).</li><li>Dijkman, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferating+cells+in+HIV+and+pamidronate-associated+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis+are+parietal+epithelial+cells.">Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.</a> Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).</li><li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+histological+patterns+in+glomerular+epithelial+cells+in+secondary+focal+segmental+glomerulosclerosis.">Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).</li><li>Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parietal+epithelial+cell+is+crucially+involved+in+human+idiopathic+focal+segmental+glomerulosclerosis.">The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cells+participate+in+the+formation+of+sclerotic+lesions+in+focal+segmental+glomerulosclerosis.">Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+origin+of+glomerular+extracapillary+lesions+from+parietal+epithelial+cells.">Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).</li><li>Smeets, B., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parietal+epithelial+cells+and+podocytes+in+glomerular+diseases.">Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases.</a> Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).</li><li>Ryu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+leakage+through+glomerular+basement+membrane+ruptures+triggers+the+proliferation+of+parietal+epithelial+cells+and+crescent+formation+in+non-inflammatory+glomerular+injury.">Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury.</a> The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).</li><li>Eymael, J., Smeets, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+fate+of+the+regenerating+cells+of+the+kidney.">Origin and fate of the regenerating cells of the kidney.</a> European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).</li><li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+progenitor+cells+contribute+to+hyperplastic+lesions+of+podocytopathies+and+crescentic+glomerulonephritis.">Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).</li><li>Eymael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+is+required+for+the+pathogenesis+of+experimental+crescentic+glomerulonephritis+and+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis.">CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).</li><li>Roeder, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ERK1/2+increases+CD44+in+glomerular+parietal+epithelial+cells+leading+to+matrix+expansion.">Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion.</a> Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).</li><li>Appel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+podocytes+from+glomerular+parietal+epithelial+cells.">Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).</li><li>Yaoita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+epithelial+cells+in+rat+glomerular+cell+culture.">Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture.</a> European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).</li><li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+Glucocorticoid+Action+in+GN.">Investigations of Glucocorticoid Action in GN.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).</li><li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture.">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li></ol>

Usando o protocolo descrito neste artigo, pode-se usar glomeruli encapsulado único para avaliar a proliferação de células epiteliais parietal, que é uma consequência da ativação de células epiteliais parietal. Este modelo ex vivo nos permitirá estudar detalhadamente as vias moleculares, que estão envolvidas na ativação de células epiteliais parietal. O método descrito baseia-se no simples conceito de dissecção renal e peneira para isolar e cultura encapsulada glomeruli e comparar a proliferação e/ou mi...

As doenças glomerulares são um importante grupo de distúrbios renais e representam uma das principais causas da doença renal em estágio terminal (ESRD). Infelizmente, as opções específicas de tratamento são limitadas e a progressão para a ESRD é inevitável. As doenças glomerulares são definidas pela presença de lesões glomerulares e podem ser agrupadas em doenças inflamatórias e não inflamatórias. Embora o insulto inicial seja diferente, estudos recentes têm demonstrado que um mecanismo celular comum leva à hiperplasia epitelial glomerular e, em últimainstância,à glomerulosclerose em todas as doenças glomerulares, independentemente da causa básica1,,2,,3,4.
Especificamente, foi demonstrado que as lesões glomeruloscleróticas são compostas principalmente de células epiteliais parietal ativadas5,6. Sob condições fisiológicas, as células epiteliais parietal são células epiteliais quiescentes planas que revestem a cápsula do Bowman do glomerulus. No entanto, qualquer lesão glomerular devido a mutações genéticas (por exemplo, citopatias específicas podocyte ou mitocondrial), inflamação ou hiperfiltração (por exemplo, causada pela redução da massa renal, hipertensão, obesidade ou mellitus diabético) pode desencadear a ativação de células epiteliais parietal. Células epiteliais parietal ativadas proliferam e depositam matriz extracelular que resulta na formação de crescentes celulares ou lesões escleróticas5,,7,,8. A progressão desses processos resulta na perda da função renal9. Portanto, a ativação de células epiteliais parietal é um fator-chave no desenvolvimento e progressão da glomerulosclerose tanto inflamatória quanto não inflamatóriaglomerular 1,,2,,3,,4,,10.
Os processos moleculares que mediam a ativação de células epiteliais parietal ainda são amplamente desconhecidos. Estudos recentes mostram que as células epiteliais parietal ativadas de novo expressAM CD44, um receptor que é importante para a ativação de diferentes caminhos envolvidos na proliferação e migração celular. Além disso, a inibição do CD44 mostrou-se inibir a ativação de células epiteliais parietal e atenuar a progressão da formação crescente e glomerulosclerose em modelos animais de doenças inflamatórias e glomerulares não inflamatórias11,,12.
Como a ativação de células epiteliais parietal é um ator-chave para o desenvolvimento da glomerulosclerose e formação crescente, a inibição dessas células poderia retardar a progressão de doenças glomerulares. A elucidação das vias moleculares que conduzem a ativação epitelial parietal pode levar ao desenvolvimento de intervenções terapêuticas específicas que atenuam a formação das lesões hiperplásticas e glomeruloscleróticas na doença glomerular.
Em modelos animais experimentais, é frequentemente difícil fornecer evidências para um efeito direto de uma expressão genética alterada (modelos de knock-out ou modelos de camundongos transgênicos) ou tratamento medicamentoso nas células epiteliais parietal. Em um camundongo knock-out convencional, as alterações in vivo observadas podem ser explicadas por mudanças diretas nas células epiteliais parietal. No entanto, uma vez que a expressão genética também é alterada em outros tipos de células dentro do mouse, não se pode excluir efeitos indiretos mediados por outros tipos de células. O desenvolvimento de camundongos cre-lox condicional impulsionados por promotores principalmente ativos em células epiteliais parietal forneceu uma solução em alguns casos13. No entanto, modelos transgênicos condicionais são complexos e, embora linhas mais condicionais se tornem disponíveis, para muitas das linhas convencionais de camundongos ou transgênicos ainda não há um substituto condicional.
Para estudar os efeitos diretos nas células epiteliais parietal, nosso grupo desenvolveu um ensaio ex vivo usando glomeruli encapsulado único isolado dos rins do rato para medir e analisar a proliferação e migração de células epiteliais parietal. Este método nos permitirá determinar efeitos específicos de células epiteliais parietal e encontrar caminhos responsáveis para a ativação de células epiteliais parietal e testar opções de tratamento para inibir essa ativação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >24-well cell culture plate</td>
			<td >Corning Costar</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-CD31</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Endothelial cell marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken-anti-rat Alexa 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI-Fluoromount G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>Mounting medium containing DAPI</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital inverted light microscope</td>
			<td>Westburg, EVOS fl microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >donkey-anti-goat Alexa 568</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >donkey-anti-rabbit Alexa 568</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;(used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM-MV Single Quots kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Calf Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat-anti-synaptopodin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Podocyte marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hanks&#39;Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ software</td>
			<td >FIJI 1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >petri dish</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td>size 100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rabbit-anti-claudin1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rabbit-anti-SSeCKS</td>
			<td>Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA</td>
			<td>kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rat-anti-CD44</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel</td>
			<td >Dahlhausen</td>
			<td>size 10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sieves&#160;</td>
			<td >Endecotts Ltd</td>
			<td>size 300 &#181;m, 75 &#181;m, 53 &#181;m, steel</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe</td>
			<td >BD Plastipak</td>
			<td>size: 20 ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra-Low Attachment Microplates&#160;</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>6-well plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glomerular outgrowth as an ex vivo assay to analyze pathways involved in parietal epithelial cell activation

A ativação da célula epitelial parietal (PEC) é um dos fatores-chave envolvidos no desenvolvimento e progressão da glomerulosclerose. A inibição de vias envolvidas na ativação de células epiteliais parietal pode, portanto, ser uma ferramenta para atenuar a progressão de doenças glomerulares. Este artigo descreve um método para cultivar e analisar o crescimento das células epiteliais parietal do glomeruli encapsulado isolado do rim do rato. Após dissecar rins isolados de camundongos, o tecido é picado, e glomeruli são isolados por peneira. Glomeruli encapsulado são coletados, e glomeruli único são cultivados por 6 dias para obter crescimento glomerular de células epiteliais parietal. Durante esse período, a proliferação e migração de células epiteliais parietal pode ser analisada determinando o número celular ou a área superficial das células em crescimento. Este ensaio pode, portanto, ser usado como uma ferramenta para estudar os efeitos de uma expressão genética alterada em camundongos transgênicos ou nocautes ou os efeitos das condições culturais nas características e sinalização das células epiteliais parietal. Utilizando este método, podem ser estudadas caminhos importantes envolvidos no processo de ativação de células epiteliais parietal e, consequentemente, na glomerulosclerose.

Um diagrama sistemático do método para realizar o ensaio glomerular de crescimento é mostrado na Figura 1. A Figura 2A-D mostra crescimentos glomerulares de glomeruli encapsulado em diferentes pontos de tempo observados usando microscopia leve. Os crescimentos são mostrados nos dias 2, 4 e 6 (Figura 2B-D) na cultura após o isolamento glomerulus do rim do rato. P...

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Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Este artigo descreve um método para culminar e analisar os crescimentos de células epiteliais parieais glomerulares de glomeruli encapsulado isolados do rim do rato. Este método pode ser usado para estudar caminhos envolvidos na proliferação e migração de células epiteliais parietal.

Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

A ativação das células epiteliais parietal é um fator-chave no desenvolvimento do tecido cicatricial no glomerulus do rim. Usando esse método, podemos estudar os processos celulares envolvidos nesta ativação e, com sorte, encontrar opções de tratamento para retardar ou até mesmo parar a progressão da doença. A principal vantagem de nossa técnica é que usamos células primárias que crescem diretamente do glomeruli isolado.Depois de liberar os rins, como descrito no manuscrito do texto, segure o rim com os fórceps cirúrgicos e use outro par de fórceps para retirar as cápsulas renais. Depois disso, coloque os rins nos poços de uma placa de seis poços que cada um contém dois mililitros de HBSS e coloque a placa de cultura no gelo. Primeiro, transfira os rins para uma placa de Petri de 100 milímetros e use dois bisturis para pica-los em pequenos pedaços que são aproximadamente de um a dois milímetros.Mantenha as peças de rim picadas molhadas com HBSS. Em seguida, coloque as peças nos rins em cima de uma peneira metálica de 300 micrômetros e pressione o rim através da peneira usando o êmbolo de uma seringa de 20 mililitros. Enxágüe repetidamente a peneira com HBSS no meio e use uma pipeta sorológica para coletar o fluxo e transferi-lo para uma placa de Petri limpa.Use um bisturi para raspar tudo o que resta na parte inferior da peneira e transferi-lo para o rim coletado homogeneizar. Enxágüe o rim homogeneizar através de uma peneira de 75 e 53 micrômetros com HBSS. Em seguida, lave as duas peneiras com HBSS para remover todas as estruturas menores.Recolher as estruturas renais e o material que permaneceram nas peneiras lavando a superfície superior de cada um com DMEM suplementado com soro de bezerro fetal de 20% e transferir o material para os poços de uma micropla placa de apego ultra-baixa de seis poços. Leve a microplacão de fixação ultra-baixa para um microscópio de luz invertida e use uma pipeta de 20 microliteres que recolheu glomeruli encapsulado e ou descapsulado. Depois de pegar um único glomerulus na ponta da pipeta, adicione um novo meio DMEM sem material renal coletado na mesma ponta de pipeta a um volume de 20 microliters.Transfira o glomerulus único com o meio DMEM para o centro de um poço de uma placa de cultura celular de 24 poços e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três horas para permitir a fixação do glomerulus ao centro do poço. Após a incubação, o glomerulus será anexado ao centro do poço. Adicione cuidadosamente 500 microliters de meio basal endotelial suplementados com um kit de fator de crescimento e um adicional de 5% FBS e 1%penicilina e estreptomicina para cada poço.Cultura o glomeruli único a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis dias. Após seis dias de incubação, use um microscópio de luz invertida digital para tirar imagens e analisar o crescimento glomerular. Usando um software de análise de imagem, determine a área de superfície do crescimento glomerular abrindo um dos arquivos de imagem com uma barra de escala.Desenhe uma linha reta na barra de escala e clique em Analisar e, em seguida, meça para determinar a distância em pixels. Para determinar a escala, clique em Analisar e Definir escala e inserir a distância conhecida em pixels, a distância conhecida e a unidade de comprimento. Clique em Ok quando terminar.Clique em Analisar e Definir Medidas. Em seguida, verifique as opções de Área e Etiqueta de Exibição. Clique em Ok quando terminar.Em seguida, desenhe uma seleção à mão livre em torno do crescimento glomerular. Clique em Analisar e medir para exibir uma tabela de resultados, que contém a área de crescimento superficial na escala determinada anteriormente. neste estudo, as células epiteliais parietal glomerulares superfaturadas de glomeruli encapsulada são isoladas de rins de camundongos, cultivadas e analisadas.Imagens representativas de microscopia luminosa mostram os crescimentos glomerulares em diferentes pontos de tempo durante a cultura após o glomerulus ser isolado dos rins do rato. Para validar que as células de crescimento são células epiteliais parietal, glomeruli descapsulado também são isolados e cultivados por seis dias. Glomeruli decapsulado não mostra crescimento celular durante este período de incubação.A coloração imunofluorescente é então realizada para diferentes marcadores de células epiteliais parietal, marcadores específicos do local fotográfico, bem como marcadores celulares endoteliais. Os resultados validam que as células que se sobressalam, de fato, são células epiteliais parietal. Glomeruli associado a partir de camundongos knockout CD44 mostram um número reduzido de células em crescimento, bem como uma área de superfície reduzida de crescimento glomerular em comparação com o glomeruli isolado de ratos do tipo selvagem.Isso sugere um papel importante para o CD44 na ativação de células epiteliais parietal. Usando essa técnica, também é possível estudar os efeitos em drogas na ativação de células epiteliais parietal. Isso pode ser feito tratando o glomeruli isolado com a droga de sua escolha e para analisar as diferenças no crescimento celular e migração celular.

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