Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مستشفي الأطفال بوسطن لبدء الأموال إلى A.B., ALSA منحه nr. IIP-343 إلى عضو البرلمان ، ومكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال برنامج بحوث التصلب الجانبي الضموري تحت الجائزة رقم W81XWH-17-1-0036 إلى عضو البرلمان ونحن نعترف DFCI تدفق الخلوية الاساسيه للدعم التقني.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية (IACUC) في معهد دانا فاربر للسرطان (البروتوكول رقم 16-024).
1-اعداد الحلول اللازمة للتجربة
<ol><li>أعد 1x محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عن طريق تمييع 10x HBSS بالماء المعقم. قبل البرد الحل علي الجلي...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

هنا نحن وصف بروتوكول لتنقيه المشتركة والمتزامنة تحليل التدفق الخلوي لبعض الخلايا العصبية الأكثر صله من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. تقليديا ، تم تطبيق التحليلات النسيجية لوصف توزيع الجسيمات النانويه أو كفاءه المحولات الفيروسية في CNS5،13، أو لتوفير رؤى حول ...

أصبحت تقنيات توصيل الجينات والادويه (مثل النواقل الفيروسية والجسيمات النانويه) أداه قويه يمكن تطبيقها للحصول علي رؤى أفضل حول المسارات الجزيئية المحددة التي تم تغييرها في امراض الأعصاب ولتطوير الطرق العلاجية المبتكرة1،2،3. وتعتمد الاستفادة المثلي من هذه الاداات علي القياس الكمي لما يلي: (1) مدي التغلغل في الجهاز العصبي العام عند طرق الاداره المختلفة و (2) استهداف فئات معينه من الخلايا. وعاده ما يتم تطبيق التحليلات النسيجية لتصور الجينات مراسل الفلورسنت أو فلوريسسينتلي الموسومة النانويه في مختلف المناطق العصبية وعبر أنواع الخلايا المختلفة ، التي حددتها المناعية لعلامات خليه محدده4،5. وعلي الرغم من ان هذا النهج يوفر معلومات قيمه عن التوزيع الإحيائي للجينات التي تدار بالجينات أو أدوات تسليم المخدرات ، فان هذه التقنية يمكن ان تستغرق وقتا طويلا وتكون كثيفه العمالة لأنها تتطلب: (1) تثبيت الانسجه ، أو الحفظ بالتبريد ، أو تضمين البارافين وتقطيعها ؛ (2) تلطيخ لعلامات خلوية محدده تتطلب أحيانا استرجاع مستضد ؛ (3) الاستحواذ عن طريق المجهر الفلوري ، الذي يسمح عاده بتحليل عدد محدود من العلامات المختلفة في نفس التجربة ؛ (4) معالجه الصور للسماح بالتحديد الكمي المناسب لاشاره الفائدة.
وقد أصبح التدفق الخلوي تقنيه تستخدم علي نطاق واسع والتي تستفيد من علامات الفلورسنت محدده جدا للسماح ليس فقط التقييم الكمي السريع لمختلف الظواهر الخلوية في تعليق الخلية ، استنادا إلى التعبير عن المستضدات السطحية أو داخل الخلايا ، ولكن أيضا قياسات وظيفية (مثل معدل المبرمج ، والانتشار ومن الممكن أيضا العزل المادي للخلايا من خلال فرز خلايا الفلورسنت المنشطة ، مما يسمح بالمزيد من التطبيقات النهائية (علي سبيل المثال ، ثقافة الخلايا ، RNAseq ، التحاليل البيوكيميائية الخ) 6،7،8.
تجانس الانسجه هو خطوه حاسمه ضرورية للحصول علي تعليق خليه واحده للسماح موثوق بها وقابله للتكرار التقييمات الخلوية تدفق المصب. وقد وصفت طرق مختلفه لتجانس انسجه المخ الكبار ، وذلك أساسا بهدف عزل الخلايا الدقيقة الصغرى9،10،11؛ ويمكن تصنيفها بشكل عام في فئتين رئيسيتين: (1) التفكك الميكانيكي ، الذي يستخدم الطحن أو القص القوه من خلال الخالط Dounce (DH) لتمزيق الخلايا من منافذها وتشكيل تعليق خليه واحده متجانسة نسبيا ، و (2) الهضم الانزيمي ، الذي يعتمد علي احتضان قطع الانسجه المفرومة في 37 درجه مئوية في وجود الانزيمات البروتينية ، مثل التريبسين أو بابين ، لصالح تدهور المصفوفة خارج الخلية لإنشاء تعليق خليه متجانسة إلى حد ما12.
بغض الفضل عن الطريقة التي يتم استخدامها ، ينصح خطوه تنقيه بعد تجانس الانسجه لأزاله الميلين من خلال طرد علي التدرج الكثافة أو عن طريق اختيار المغناطيسي9،12، قبل الانتقال إلى التطبيقات المصب.
هنا ، ونحن وصف طريقه معالجه الانسجه علي أساس الهضم بابين (PD) تليها تنقيه علي التدرج الكثافة ، الأمثل للحصول علي تعليق الخلايا غير المتجانسة قابله للحياة من الدماغ الماوس أو الحبل الشوكي في طريقه حساسة للوقت ومناسبه لقياس التدفق الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فاننا وصف لوحه التدفق الخلوي 9 لون واستراتيجية النابضة التي اعتمدناها في المختبر للسماح التمييز في وقت واحد من مختلف السكان CNS ، والخلايا الحية/الميتة أو الايجابيه للصحفيين الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر أو صبغ الرومين. من خلال تطبيق هذا التحليل الخلوي التدفق ، يمكننا مقارنه الطرق المختلفة لمعالجه الانسجه ، اي PD مقابل DH ، من حيث الحفاظ علي القدرة الخلوية والغلة من أنواع الخلايا المختلفة.
التفاصيل التي نقدمها هنا يمكن ان توعز قرار بشان بروتوكول التجانس وتركيبه الأجسام المضادة لاستخدامها في لوحه تدفق الخلوي ، استنادا إلى نوع الخلية المحددة (ق) من الفائدة والتحليلات المصب (علي سبيل المثال ، حساسة لدرجه الحرارة التطبيقات ، وتتبع علامات الفلورسنت محدده ، في المختبر الثقافة ، والتحليلات الوظيفية).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

وقد فتحت التطورات الاخيره في مجال النواقل الفيروسية والعلوم النانوماتيرياله الطريق امام نهج متطورة جديده للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي أو التلاعب به (CNS). ومع ذلك ، فان الاستفادة المثلي من هذه التكنولوجيات ستستفيد من الأساليب التي تسمح بالتحديد السريع والمبسط لمدي التركيز العصبي الخلوي والاستهداف الخاص بالخلايا علي أداره النواقل الفيروسية أو الجسيمات النانويه في الجسم. هنا ، نقدم البروتوكول الذي يستفيد من الانتاجيه العالية وقدرات الإرسال المتعدد لقياس التدفق الخلوي للسماح بالتحديد الكمي المباشر للأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المعزولة عن دماغ الماوس أو الحبل الشوكي ، اي الخلايا الصغيرة/الضامة ، اللمفاويات ، استروسينتيس نحن نطبق هذا النهج لتسليط الضوء علي الاختلافات الحاسمة بين طريقتين تجانس الانسجه من حيث الغلة الخلية ، والقدرة علي البقاء والتكوين. وهذا يمكن ان يرشد المستخدم لاختيار أفضل طريقه اعتمادا علي نوع (s) الخلية من الفائدة وتطبيق معين. هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل التوزيع التشريحي ، لان النسيج متجانس لتوليد تعليق خليه واحده. ومع ذلك ، فانه يسمح للعمل مع خلايا قابله للحياة وانه يمكن الجمع بين الخلية الفرز ، فتح الطريق امام العديد من التطبيقات التي يمكن ان توسع ذخيرة الاداات في ايدي الأعصاب ، بدءا من إنشاء الثقافات الاوليه المستمدة من الخلايا النقية ، إلى تحليلات التعبير الجيني والاختبارات البيوكيميائية أو الوظيفية علي الأنواع الفرعية المحددة جيدا في سياق امراض الأعصاب

قارننا طريقتين تجانس مختلفه (DH مقابل PD) تطبيقها علي الدماغ الماوس والحبل الشوكي ، لاختبار الكفاءة في استرداد أنواع الخلايا القابلة للحياة مختلفه مناسبه للتطبيقات المصب. للقيام بذلك ، قمنا باستغلال 9-لون تدفق لوحه الخلوي مصممه لتوصيف ، في نفس العينة ، وأنواع مختلفه من الخلايا العصبية بما ف?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

نقدم طريقه قياس التدفق الخلوي للتعرف علي أنواع مختلفه من الخلايا التي يتم استردادها من دماغ الماوس أو الحبل الشوكي في نفس الوقت. ويمكن استغلال هذه الطريقة لعزل أو توصيف مجموعات الخلايا النقية في الامراض التنكسية العصبية أو لقياس مدي استهداف الخلايا في الاداره المجرية لنواقل أو جسيمات نانويه فيروسية.

توصيف التدفق الخلوي المتزامن لأنواع الخلايا المتعددة التي تم استردادها من الدماغ/الحبل الشوكي من خلال أساليب تجانس مختلفه

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

تطوير الجينات الانتقائية وأدوات تسليم المخدرات لعلاج الاضطرابات العصبية، يتطلب تحديد كم وتوصيف استهداف الخلايا، عند إعادة الإدارة، أو ناقلات الفيروسية، أو الجسيمات النانوية. لديهم القدرة على الإنتاجية ومتعددة من تدفق القياس الخلوي، ويسمح لتحديد مباشرة وفي وقت واحد من أنواع الخلايا المتعددة من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. وسوف يكون إثبات الإجراء فرانسيسكو خافيير مولينا استيفيز، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبر الكسندر.بعد حصاد الدماغ والحبل الشوكي من فأر C57 Black 6 البالغ من العمر ثمانية أسابيع ، ضع الأنسجة في آبار فردية لطبقة من ستة آبار ، تحتوي على ملليلترين من الجليد البارد HPSS لكل بئر على الجليد. تقسيم كل الأنسجة المحصودة إلى قطعتين متساويتين. واستخدام مقص ل mince نصف عينة كل نسيج في قطعة سميكة ملليمتر واحد إلى اثنين.عندما تم تفتيت جميع الأنسجة، قبل شطف 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح في HPSS، واستخدام ماصة لنقل كل تعليق الأنسجة إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. شطف الآبار مع ملليلتر اثنين إضافية من HPSS في البئر. وسحب يغسل في الأنابيب المخروطية 15 ملليلتر المقابلة.رواسب العينات عن طريق الطرد المركزي. وخلط 50 ميكرولترات من انزيم P من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية مع 1, 900 ميكرولترات من العازلة X من عدة لكل عينة. دافئة مزيج الانزيم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.ويُفطّن المُنْتَرَح من كلّ أنبوب جمع الأنسجة. عندما يكون خليط الإنزيم جاهزًا، أضف 1.95 ملليلتر من المحلل لكل عينة. ودوامة بلطف لإعادة تعليق الكريات.المقبل، احتضان العينات على عجلة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، ومزيج 10 ميكرولترات من انزيم A مع 20 ميكرولترات من Y العازلة لكل عينة. Prewarm محلول الانزيم الثاني في 37 درجة مئوية، قبل إضافة 30 ميكرولترات من الحل إلى كل حل الأنسجة في نهاية الحضانة اهتزاز. استخدم 1000 طرف ماصة ميكروليت، مشطف مسبقًا مع HPSS لخلط كل عينة بلطف.وإرجاع العينات إلى العجلة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اعتقال ردود الفعل الأنزيمية مع 10 ملليلتر من الجليد البارد HPSS. ورواسب العينات عن طريق الطرد المركزي.في نهاية الطرد المركزي، إعادة تعليق الكريات في سبعة ملليلتر من الجليد البارد HPSS لكل أنبوب. ودوامة بلطف كل عينة، قبل عقد الأنابيب على الجليد. بالنسبة لتجانس الأنسجة، أضف ثلاثة ملليلترات من HPSS المبردة مسبقًا إلى مدفع الهاون الزجاجي المبرد مسبقًا لمطحنة أنسجة الدونسي، ونقل النصف الثاني من عينة واحدة من أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي المقطوعة إلى هاون.بلطف لطخ الأنسجة مع 10 السكتات الدماغية من Pestle A، تليها 10 السكتات الدماغية من ب. Pestle ونقل خليط متجانس في أنبوب جديد مخروطي 15 ملليلتر. املأ الأنبوب إلى حجم نهائي من 10 ملليلترات مع HPSS المبردة مسبقًا للطرد المركزي. وإعادة تعليق بيليه في سبعة ملليلتر من HPSS الطازجة مع دوامة، قبل عقد العينة على الجليد.لإزالة الحطام، إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول Percoll متساوي التوتر المبردة مسبقاً إلى كل عينة هضمية أو متجانسة. ودوامة بلطف العينات للتأكد من أنها مختلطة متجانسة. المقبل، الطرد المركزي العينات، وإزالة القرص الأبيض بعناية من الحطام والميلين العائمة على سطح المحلل.عندما تم التخلص من الحطام ، وجمع كل ما عدا 100 ميكرولترات الماضي من عظمى من كل أنبوب دون إزعاج الكريات. إعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من حل BL FACS لنقلها إلى أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية. بعد هذا التكامل مع حل Percoll، من المهم إزالة القرص الحطام وsupernatant بعناية فائقة دون إزاحة بيليه الخلية لتجنب فقدان العينة.بعد الطرد المركزي، وpirate بعناية كبرى من كل أنبوب، وإعادة تعليق الكريات في 350 ميكرولترات من FACS BL الطازجة لكل أنبوب. لتحليل تدفق الخلايا الخلوية من أنواع الخلايا المعزولة، احتضان العينات مع خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من كتلة FC لكل أنبوب لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية قبل إضافة الأجسام المضادة المناسبة لكل أنبوب وفقا للبروتوكول الدائمة المبينة في الجدول. دوامة كل أنبوب لمدة خمس ثوان لخلط.ووضع العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب، والطرد المركزي. إعادة تعليق الكريات في الحجم المناسب من streptavidin لكل أنبوب.بعد دوامة لخلط، احتضان العينات لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب كما هو موضح. بعد التخلص من super، إعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من FACS BL الطازجة لكل أنبوب.وتسمية كل عينة مع خمسة ميكرولترات من 7-AAD. ثم تخزين العينات في أربع درجات مئوية محمية من الضوء حتى تحليل cytofluorometric. ينتج أسلوب التجانس زيادة غلة الخلايا من كل من الدماغ والحبل الشوكي بشكل عام ، ولكن غالبية الخلايا التي يتم استردادها عادة ما تكون ميتة ، مما يؤدي فقط إلى شفاء حوالي 14 ٪ من الخلايا القابلة للحياة من الدماغ ، وقرابة 10 ٪ تلتئم من الحبل الشوكي.في المقابل, طريقة الهضم papain النتائج في الحفاظ بشكل أفضل عموما من قابلية البقاء الخلوية. تحليل تعليق خلايا الدماغ والحبل الشوكي مع تسعة لون ثنائي التدفق الخلوي، ويكشف عن وجود CD45 + CD11b + microglia، و الضامة. و CD45+CD11b-اللمفاويات في كلا النسيجين.ويمكن بعد ذلك التمييز بين مجموعات الخلايا CD45 وفقاً لإيجابيتها بالنسبة للعلامات الفلكية، أو علامات القلة oligodendrocyte، أو تعبير علامة السطح الوحشية والبطانية. باستخدام طريقة التجانس، ما بين 32 إلى 38٪ من الخلايا القابلة للحياة هي من أصل دموي. في حين أن طريقة الهضم الأنزيمية النتائج في الحصول على جزء كبير جدا من خلايا CD45-غير مكون للدم.من اللافت للنظر أن CD45+CD11b+microglia و الضامة تمثل الكسر الخلية الأكثر وفرة قابلة للحياة مع طريقة التجانس. طريقة الهضم، ومع ذلك، تنتج تمثيل أكثر التجانس من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا الفلكية، oligodendrocytes، الخلايا البطانية، والخلايا العصبية. هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات، ويمكن استغلاله لعدة تطبيقات في المصب مثل القياس الكمي أو عزل الخلايا الفرعية المحددة، أو الثقافة الأولية، أو الكيمياء الحيوية، أو تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي.لقد نفذنا هذا البروتوكول لتقييم التعبير الجيني والتوقيعات الوظيفية لمختلف سكان الجهاز العصبي المركزي أثناء هذا التقدم، أو بعد العلاج في نموذج فأر من التصلب الجانبي داخل الغدد.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

الحادة والمزمنة الاختبارات الحسية اللمس بعد إصابة الحبل الشوكي في الجرذان

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

ونظام القياس عن بعد راديو لمراقبة وظيفة القلب والأوعية الدموية في الحبل الشوكي مع الفئران Transection والعصبية الجذعية الجنينية الطعوم خلية

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

في المختبر توصيف الوظيفي للماوس القولون والمستقيم وارد النهايات

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

على النقيض المحسن التصوير بالموجات فوق الصوتية لتقييم الحبل الشوكي تدفق الدم في التجريبية العمود الفقري اصابات الحبل

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

في وقت واحد التصوير PET / MRI خلال الماوس الدماغي نقص الأكسجة-نقص التروية

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

وحديثي الولادة ماوس الحبل الشوكي ضغط إصابة نموذج

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...