Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Denne undersøgelse blev finansieret af Boston children's Hospital start-up midler til A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 til M.P., og kontoret for den assisterende forsvarsminister for Sundhedsanliggender gennem Amyotrophic lateral sklerose Research program under Award No. W81XWH-17-1-0036 til M.P. Vi anerkender DFCI flow cytometry Core for teknisk support.

Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Dana Farber Cancer Institute (protokolnummer 16-024).
1. forberedelse af de nødvendige løsninger til eksperimentet
<ol><li>Forbered 1x Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS) ved at fortynde 10x HBSS med sterilt vand. Pre-chill opløsningen på is. Der skal bruges mindst 25 mL opløsning til hver prøve.</li>
	<li>Forbered isotonisk Percoll-opløsning (IPS) ved...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

Heri beskriver vi en protokol for Co-oprensning og samtidige flow cytometrisk analyse af nogle af de mest relevante CNS celler fra mus hjerne og rygmarv. Traditionelt er der anvendt histologiske analyser til at beskrive fordelingen af nanopartikler eller transduktiviteten af virale vektorer i CNS5,13eller til at give indsigt i morfologiske og molekylære forandringer, der forekommer i specifikke celletyper under en patologi eller ved farmakologisk behandling<sup ...

Teknologier til levering af gener og stoffer (såsom virale vektorer og nanopartikler) er blevet et effektivt værktøj, der kan anvendes til at opnå bedre indsigt i specifikke molekylære veje, som er ændret i neurodegenerative sygdomme, og til udvikling af innovative terapeutiske tilgange1,2,3. Optimering af disse værktøjer afhænger af kvantificering af: (1) omfanget af indtrængning i CNS på forskellige administrationsveje og (2) målretning af specifikke cellepopulationer. Histologiske analyser anvendes sædvanligvis til at visualisere fluorescerende reporter gener eller fluorercently-mærkede nanopartikler i forskellige CNS-områder og på tværs af forskellige celletyper, identificeret ved immun farvning for specifikke celle markører4,5. Selv om denne fremgangsmåde giver værdifulde oplysninger om biodistributionen af det administrerede gen-eller lægemiddel leverings værktøj, kan teknikken være tidskrævende og arbejdskrævende, da den kræver: (1) vævs fiksering, kryopræservering eller paraffin-indlejring og udskæring; (2) farvning for specifikke cellulære markører, der sommetider kræver antigen hentning; 3) erhvervelse ved Fluorescens mikroskopi, som sædvanligvis gør det muligt at analysere et begrænset antal forskellige markører inden for samme eksperiment (4) billedbehandling for at muliggøre korrekt kvantificering af interesse signalet.
Flowcytometri er blevet en meget anvendt teknik, der udnytter meget specifikke fluorescerende markører til ikke blot at tillade en hurtig kvantitativ vurdering af forskellige celle fænotyper i celle suspensioner baseret på ekspression af overflade eller intracellulære antigener, men også funktionelle målinger (f. eks. apoptose, proliferation, celle cyklus analyse osv.). Fysisk isolation af celler ved hjælp af fluorescerende aktiveret celle sortering er også muligt, hvilket giver mulighed for yderligere downstream-applikationer (f. eks. cellekultur, RNAseq, biokemiske analyser osv.) 6,7,8.
Vævshomogenisering er et afgørende skridt, der er nødvendigt for at opnå en enkelt cellesuspension for at tillade pålidelige og reproducerbare downstream flow cytometriske evalueringer. Forskellige metoder er blevet beskrevet for voksne hjernevæv homogenisering, hovedsagelig med det formål at isolere microglia celler9,10,11; de kan generelt inddeles i to hovedkategorier: (1) mekanisk dissociation, som anvender slibe-eller klippe kraft gennem en Dounce-homogenisator (DH) til at rive celler fra hinanden fra deres nicher og danner en relativt homogen enkelt cellesuspension, og (2) enzymatisk fordøjelse, som er afhængig af inkubation af hakket væv klumper ved 37 °C i nærværelse af Proteolytiske enzymer, såsom trypsin eller papain, favorisere nedbrydningen af den ekstracellulære matrix til at skabe en temmelig homogeniseret cellesuspension12.
Uanset hvilken metode der anvendes, anbefales et rensningstrin efter vævshomogenisering for at fjerne myelin gennem centrifugering på en tæthed gradient eller ved magnetisk valg9,12, før du flytter til downstream-applikationer.
Her beskriver vi en vævs behandlingsmetode baseret på papain fordøjelse (PD) efterfulgt af rensning på en tæthed gradient, optimeret til at opnå levedygtige heterogene celle suspensioner fra musehjerne eller rygmarv i en tidsfølsom måde og egnet til flow cytometry. Desuden beskriver vi en 9-Color flow flowcytometri panel og gating strategi, vi vedtog i laboratoriet for at muliggøre samtidig diskrimination af forskellige CNS-populationer, levende/døde celler eller positivitet for fluorescerende journalister såsom grøn fluorescerende protein eller b farvestof. Ved at anvende denne flow cytometrisk analyse, vi kan sammenligne forskellige metoder til vævs behandling, dvs, PD versus DH, med hensyn til bevarelse af cellulære levedygtighed og udbytter af forskellige celletyper.
De oplysninger, vi giver heri, kan instruere beslutning om homogenisering protokol og antistof kombination til brug i flow flowcytometri panel, baseret på den specifikke celletype (r) af interesse og downstream analyser (f. eks temperatur-følsomme anvendelser, sporing af specifikke fluorescerende markører, in vitro-kultur, funktionelle analyser).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

Nylige fremskridt inden for viral vektor og nanomateriale Sciences har banet vejen for nye banebrydende tilgange til at undersøge eller manipulere centralnervesystemet (CNS). Yderligere optimering af disse teknologier vil imidlertid drage fordel af metoder, som muliggør hurtig og strømlinet bestemmelse af omfanget af CNS og celle specifik målretning efter administration af virale vektorer eller nanopartikler i kroppen. Her præsenterer vi en protokol, der udnytter de høje gennemløb og multiplexing kapaciteter af flow flowcytometri til at tillade en enkel kvantificering af forskellige celle undertyper isoleret fra mus hjerne eller rygmarv, nemlig microglia/makrofager, lymfocytter, astrocytter, oligodendrocytter, neuroner og endotelceller. Vi anvender denne fremgangsmåde til at fremhæve kritiske forskelle mellem to vævshomogenisering metoder med hensyn til celle udbytte, levedygtighed og sammensætning. Dette kunne instruere brugeren til at vælge den bedste metode afhængigt af celletype (r) af interesse og det specifikke program. Denne metode er ikke egnet til analyse af anatomisk fordeling, da vævet er homogeniseret til at generere en enkelt cellesuspension. Men det giver mulighed for at arbejde med levedygtige celler, og det kan kombineres med celle sortering, åbning af vejen for flere applikationer, der kunne udvide repertoiret af værktøjer i hænderne på neurovidenskabs manden, lige fra etablering af primære kulturer afledt af ren cellepopulationer, til genekspression analyser og biokemiske eller funktionelle assays på veldefinerede celle undertyper i forbindelse med neurodegenerative sygdomme, ved farmakologisk behandling eller genterapi.

Vi sammenlignede to forskellige homogenisering metoder (DH versus PD) anvendes til mus hjerne og rygmarv, at teste effektiviteten i at hente forskellige levedygtige celletyper egnet til downstream-applikationer. For at gøre det, vi udnyttede en 9-farve flow flowcytometri panel designet til at karakterisere, i samme prøve, forskellige CNS celletyper herunder microglia, lymfocytter, neuroner, astrocytter, oligodendrocytter og endothelium.
Væv fra hjernen og rygmarven blev hentet fra forskelli...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Vi præsenterer en flow cytometri metode til at identificere samtidigt forskellige celletyper hentet fra mus hjerne eller rygmarv. Denne metode kan udnyttes til at isolere eller karakterisere rene cellepopulationer i neurodegenerative sygdomme eller til at kvantificere omfanget af celle målretning ved in vivo administration af virale vektorer eller nanopartikler.

Samtidige flow Cytometrisk karakterisering af flere celletyper hentet fra mus hjerne/rygmarv gennem forskellige homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Udviklingen af selektive gen-og lægemiddellevering værktøjer til behandling af neurodegenerative lidelser, kræver kvantificering og karakterisering af celle målretning, efter re-administration, eller virale vektorer, eller nanopartikler. De har gennemløb og multiplexing kapaciteter flow cytometri, giver mulighed for ligetil og samtidig identifikation af flere celletyper fra musen hjernen og rygmarven. Demonstration af proceduren vil blive Francisco Javier Molina Estevez, en post-doc fra Alexander's Laboratory.Efter høst af hjernen og rygmarven fra en otte uger gammel C57 Black 6 mus, placere væv i individuelle brønde af en seks-brønd plade, der indeholder to milliliter iskold HPSS per brønd på is. Opdel hver høstet væv i to lige store stykker. Og brug saks til at hakke den ene halvdel af hver vævsprøve i en til to millimeter tykke stykker.Når alt væv er blevet fragmenteret, for skyl en modificeret 1.000 mikroliter pipettespids i HPSS, og brug pipetten til at overføre hver vævssuspension til individuelle 15 milliliter koniske rør. Skyl brøndene med yderligere to milliliter HPSS pr. brønd. Og træk vaskene i de tilsvarende 15 milliliter koniske rør.Prøverne ved centrifugering. Og bland 50 mikroliter af enzym P fra et neuralvævsekskiviseringssæt med 1.900 mikroliter buffer X fra sættet pr. prøve. Enzymblandingen opvarmes ved 37 grader celsius i mindst 10 minutter.Og aspirere supernatant fra hvert væv indsamling rør. Når enzymblandingen er klar, tilsættes 1,95 milliliter af opløsningen til hver prøve. Og forsigtigt vortex at re-suspendere pellets.Derefter inkuberes prøverne på et hjul i 15 minutter ved 37 grader celsius, og bland 10 mikroliter af enzym A med 20 mikroliter buffer Y pr. prøve. Forvarm den anden enzymopløsning ved 37 grader celsius, før der tilsættes 30 mikroliter af opløsningen til hver vævsopløsning ved afslutningen af rysteinkubationen. Brug en 1.000 mikroliterpipettespids, der er forbeslæstet med HPSS, til forsigtigt at blande hver prøve.Og returnere prøverne til hjulet i 15 minutter ved 37 grader celsius. Ved inkubationens afslutning standses de enzymatiske reaktioner med 10 milliliter iskold HPSS. Og sediment prøverne ved centrifugering.Ved centrifugeringsens afslutning suspenderes pillerne igen i syv milliliter iskold HPSS pr. rør. Og forsigtigt vortex hver prøve, før du holder rørene på is. Til vævshomogenisering tilsættes tre milliliter forkølet HPSS til en douncevævsslibers forkølede glasmørtel, og anden halvdel af en af de høstede hjerne- eller rygmarvsvævsprøver overføres til mørtelen.Forsigtigt macerate vævet med 10 slag af Støder A, efterfulgt af 10 slag af Pestle B.Og overføre den homogeniserede blanding i en ny 15 milliliter konisk rør. Rørret til et endeligt volumen på 10 milliliter med forkølet HPSS til centrifugering. Og re-suspendere pellet i syv milliliter frisk HPSS med vortexing, før du holder prøven på is.Ved fjernelse af snavs tilsættes der tre milliliter forkølet isotonisk Percoll-opløsning til hver fordøjet eller homogeniseret prøve. Og forsigtigt vortex prøverne for at sikre, at de er homogent blandet. Dernæst centrifuge prøverne, og forsigtigt fjerne hvidlige skive af snavs og myelin flyder på overfladen af opløsningen.Når snavset er blevet kasseret, indsamles alle, men de sidste 100 mikroliter af supernatanten fra hvert rør uden at forstyrre pellets. Hver pellet suspenderes igen i en milliliter FACS BL-opløsning til overførsel til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Efter denne integration med Percoll-løsningen er det vigtigt at fjerne snavsdisken og supernatanten meget omhyggeligt uden at løsne cellepilpellet for at undgå tab af prøver.Efter centrifugering, omhyggeligt aspirere supernatant fra hvert rør, og re-suspendere pellets i 350 mikroliter af frisk FACS BL per rør. Ved cytometrisk flowanalyse af de isolerede celletyper inkuberes prøverne med fem mikrogram pr. milliliter FC-blok pr. rør i 10 minutter ved fire grader celsius, før der tilsættes et passende antistof til hvert rør i overensstemmelse med den stående protokol, der er beskrevet i tabellen. Vortex hvert rør i fem sekunder til at blande.Og læg prøverne på fire grader celsius i 15 minutter beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes prøverne med en milliliter PBS pr. rør og centrifuge. Pellets skal suspenderes igen i det passende volumen streptavidin pr. rør.Efter vortexing at blande, inkubere prøverne i 10 minutter ved fire grader celsius beskyttet mod lys. Og vask cellerne med en milliliter PBS pr. rør som påvist. Efter udsmid af supernatanterne skal pillerne igen suspenderes i 300 mikroliter af frisk FACS BL pr. rør.Og mærke hver prøve med fem mikroliter af 7-AAD. Derefter opbevares prøverne ved fire grader celsius beskyttet mod lys, indtil cytofluormetrisk analyse. Homogeniseringsmetoden giver et højere celleudbytte fra både hjernen og rygmarven generelt, men størstedelen af de genvvånede celler er typisk døde, hvilket kun resulterer i og ca. 14% helet af levedygtige celler fra hjernen, og ca. 10% helet fra rygmarven.I modsætning hertil papain fordøjelsesmetode resulterer i en samlet bedre bevarelse af cellulære levedygtighed. Analyse af hjernen og rygmarvscelle suspensioner med en ni farve bi-flow cytometri, afslører tilstedeværelsen af CD45 + CD11b + mikroglia, og makrofager. Og CD45+CD11b-lymfocytter i begge væv.CD45-celle populationer kan derefter diskrimineres i henhold til deres positivitet for astrocyt, eller oligodendrocyte markører, eller ferional og endotel overflade markør udtryk. Ved hjælp af homogeniseringsmetoden er mellem 32 og 38% af de levedygtige celler af hæmatopoietisk oprindelse. Mens enzymatisk fordøjelse metode resulterer i erhvervelse af en meget stor brøkdel af en ikke-hæmatopoietisk CD45-celler.Bemærkelsesværdigt, CD45 + CD11b + mikroglia og makrofager repræsenterer den mest rigelige levedygtige cellefraktion med homogeniseringsmetoden. Fordøjelsesmetoden producerer imidlertid en mere heterogen repræsentation af celletyper, herunder astrocytter, oligodendrocytter, endotelceller og neuroner. Denne protokol er alsidig og kan udnyttes til flere downstream-applikationer såsom kvantificering eller isolering af specifikke celleunderpopulationer, primær kultur eller biokemisk eller RNA-sekventeringsanalyse.Vi har implementeret denne protokol for at vurdere genekspression og funktionelle signaturer af forskellige CNS-populationer under denne progression, eller efter behandling i en musemodel af endotrofisk lateral sklerose.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Akut og kronisk Tactile sensorisk analyse efter Rygmarvsskader i rotter

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Indsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale prøver

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En radio-telemetri system til overvågning Kardiovaskulær funktion i rotter med Spinal Cord transection og embryonale neural stamcelle transplantater

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Funktionel karakterisering af Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Kontrast Forbedret Ultralydbilleddannelse for Vurdering af Spinal Cord Blood Flow i Experimental Rygmarvsskader

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Samtidig PET / MR Imaging Under Mouse Cerebral iskæmi Hypoxi-

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...