Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Deze studie werd gefinancierd door de start-up fondsen van het Boston Children's Hospital voor A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 tot M.P., en het kantoor van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het Amyotrofische laterale sclerose onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-17-1-0036 tot M.P. We erkennen DFCI flow Cytometrie core voor technische ondersteuning.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Dana Farber Cancer Institute (Protocolnummer 16-024).
1. voorbereiding van de oplossingen die nodig zijn voor het experiment
<ol><li>Bereid 1x Hank van gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) door het verdunen van 10x HBSS met steriel water. Pre-Chill de oplossing op ijs. Voor elk monster is ten minste 25 mL oplossing nodig.</li>
	<li>Bereid isotone Percoll-oplossing (IPS) door he...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

Hierin beschrijven we een protocol voor de co-zuivering en gelijktijdige Flow cytometrische analyse van enkele van de meest relevante CNS-cellen van muis hersenen en ruggenmerg. Traditioneel zijn histologische analyses toegepast om de verdeling van nanodeeltjes of de transductie-efficiëntie van virale vectoren in het CZS5,13te beschrijven of om inzichten te verschaffen over morfologische en moleculaire veranderingen die zich voordoen in specifieke celtypen tijde...

Technologieën voor het leveren van genen en medicijnen (zoals virale vectoren en nanodeeltjes) zijn een krachtig hulpmiddel geworden dat kan worden toegepast om beter inzicht te krijgen in specifieke moleculaire trajecten die zijn veranderd in neurodegeneratieve ziekten en voor de ontwikkeling van innovatieve therapeutische benaderingen1,2,3. Optimalisatie van deze instrumenten is afhankelijk van de kwantificering van: (1) de mate van penetratie in het CZS op verschillende toedieningswegen en (2) targeting van specifieke celpopulaties. Histologische analyses worden meestal toegepast om fluorescerende reporter-genen of fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes in verschillende CZS-gebieden en over verschillende celtypen te visualiseren, geïdentificeerd door immunokleuring voor specifieke celmarkeringen4,5. Hoewel deze aanpak waardevolle informatie verschaft over de biodistributie van het toegediende gen of medicamenteuze gereedschappen, kan de techniek tijdrovend en arbeidsintensief zijn, omdat dit vereist is: (1) weefsel fixatie, cryopreservatie of paraffine-inbedding en slicing; (2) kleuring voor specifieke cellulaire markers die soms antigeen-opvraging vereisen; (3) overname door fluorescentiemicroscopie, die gewoonlijk de analyse van een beperkt aantal verschillende markers binnen hetzelfde experiment mogelijk maakt; (4) beeldverwerking om een juiste kwantificering van het signaal van belang toe te staan.
Flow cytometrie is uitgegroeid tot een veelgebruikte techniek die gebruik maakt van zeer specifieke fluorescerende markers om niet alleen een snelle kwantitatieve evaluatie van verschillende celfenotypes in celsuspensies mogelijk te maken, op basis van de expressie van oppervlakte-of intracellulaire antigenen, maar ook functionele metingen (bijv. snelheid van apoptosis, proliferatie, celcyclus analyse, enz.). Fysiek isoleren van cellen door middel van fluorescerende geactiveerde celsortering is ook mogelijk, waardoor verdere downstreamtoepassingen (bijv. celkweek, RNAseq, biochemische analyses, enz.) 6,7,8.
Weefselhomogenisatie is een kritieke stap die noodzakelijk is om een enkelvoudige celsuspensie te verkrijgen om betrouwbare en reproduceerbaar stroomcytometrische evaluaties te kunnen ondergaan. Er zijn verschillende methoden beschreven voor de homogenisatie van volwassen hersenweefsel, voornamelijk met als doel Microglia-cellen9,10,11te isoleren; ze kunnen in het algemeen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën: (1) mechanische dissociatie, die slijp-of Afschuifkracht gebruikt door middel van een Dounce homogenisator (DH) om cellen uit hun nissen te rippen en een relatief gehomogeniseerde eencelsuspensie te vormen, en (2) enzymatische spijsvertering, die berust op incubatie van gehakt weefsel brokken bij 37 ° c in aanwezigheid van Proteolytische enzymen, zoals trypsine of papaïne, waarbij de afbraak van de extracellulaire matrix wordt begunstiging om een vrij gehomogeniseerde celsuspensie te creëren12.
Ongeacht welke methode wordt gebruikt, wordt een zuiveringsstap aanbevolen na weefselhomogenisatie om myeline te verwijderen door centrifugeren op een dichtheidsgradiënt of door magnetische selectie9,12, alvorens naar de downstreamtoepassingen te gaan.
Hier beschrijven we een weefsel verwerkingsmethode op basis van papaïne-spijsvertering (PD) gevolgd door zuivering op een dichtheidsgradiënt, geoptimaliseerd om levensvatbare heterogene celsuspensies te verkrijgen van muis hersenen of ruggenmerg in een tijdgevoelige manier en geschikt voor Flowcytometrie. Bovendien beschrijven we een 9-kleuren Flowcytometrie-paneel en de gating-strategie die we in het laboratorium hebben aangenomen om de gelijktijdige discriminatie van verschillende CNS-populaties, levende/dode cellen of positiviteit voor fluorescerende verslaggevers zoals groen fluorescerende eiwitten of Rhodamine-kleurstof mogelijk te maken. Door het toepassen van deze Flow cytometrische analyse, we kunnen vergelijken verschillende methoden van weefsel verwerking, dat wil zeggen, PD versus DH, in termen van behoud van cellulaire levensvatbaarheid en rendementen van verschillende celtypen.
De details die we hier verstrekken, kunnen een beslissing geven over het homogenisatie-protocol en de antilichaam combinatie die moet worden gebruikt in het Flowcytometrie paneel, op basis van het specifieke celtype (s) van belang en de stroomafwaartse analyses (bijv. temperatuurgevoelige toepassingen, tracering van specifieke fluorescentie markers, in vitro cultuur, functionele analyses).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

Recente ontwikkelingen in virale vector-en nanomateriaal Wetenschappen hebben de weg geopend voor nieuwe geavanceerde benaderingen om het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken of te manipuleren. Verdere optimalisatie van deze technologieën zou echter baat hebben bij methoden die een snelle en gestroomlijnde bepaling van de omvang van CNS en Cell-specifieke targeting bij toediening van virale vectoren of nanodeeltjes in het lichaam mogelijk maken. Hier presenteren we een protocol dat profiteert van de hoge doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie om een eenvoudige kwantificering van verschillende celsubtypen geïsoleerd van muis hersenen of ruggenmerg, namelijk Microglia/macrofagen, lymfocyten, astrocyten, oligodendrocyten, neuronen en endotheliale cellen toe te staan. We passen deze aanpak toe om kritische verschillen tussen twee weefselhomogenisatie methoden in termen van celopbrengst, levensvatbaarheid en samenstelling te benadrukken. Dit kan de gebruiker instrueren om de beste methode te kiezen, afhankelijk van het celtype (s) van de interesse en de specifieke toepassing. Deze methode is niet geschikt voor de analyse van anatomische verdeling, omdat het weefsel wordt gehomogeniseerd om een eencellige suspensie te genereren. Echter, het maakt het mogelijk om te werken met levensvatbare cellen en het kan worden gecombineerd met celsortering, het openen van de weg voor verschillende toepassingen die het repertoire van gereedschappen in handen van de neurowetenschapper kunnen uitbreiden, variërend van de oprichting van primaire culturen afgeleid van zuivere celpopulaties, tot genexpressie analyses en biochemische of functionele assays op goed gedefinieerde celsubtypen in de context van neurodegeneratieve ziekten, bij farmacologische behandeling of gentherapie.

We vergeleek twee verschillende homogenisatie methoden (DH versus PD) toegepast op muis hersenen en ruggenmerg, om de efficiëntie te testen bij het ophalen van verschillende levensvatbare celtypen die geschikt zijn voor downstreamtoepassingen. Om dit te doen, we uitgebuit een 9-Color flow cytometrie panel ontworpen om te karakteriseren, in hetzelfde monster, verschillende CNS celtypen, waaronder Microglia, lymfocyten, neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en endotheel.
Hersenen en ruggenmerg...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.

Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

De ontwikkeling van selectieve gen- en drugleveringsinstrumenten voor de behandeling van de neurodegeneratieve aandoeningen vereist de kwantificering en karakterisering van celtargeting, bij herbe toediening, of virale vectoren, of nanodeeltjes. Ze hebben doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie, maakt de eenvoudige en gelijktijdige identificatie van meerdere celtypes uit de muis hersenen en het ruggenmerg. Het demonstreren van de procedure zal Francisco Javier Molina Estevez, een post-doc van Alexander's Laboratory.Na het oogsten van de hersenen en het ruggenmerg van een acht weken oude C57 Black 6 muis, plaats de weefsels in individuele putten van een zes-put plaat, met twee milliliter ijskoude HPSS per goed op ijs. Verdeel elk geoogst weefsel in twee gelijke stukken. En gebruik een schaar om de helft van elk weefselmonster in één tot twee millimeter dikke stukken te hakken.Wanneer alle weefsels zijn gefragmenteerd, pre-spoel een gemodificeerde 1,000 microliter pipet tip in HPSS, en gebruik de pipet om elke weefsel suspensie over te brengen in individuele 15 milliliter conische buizen. Spoel de putten af met nog eens twee milliliter HPSS per put. En trek de wasbeurten in de overeenkomstige 15 milliliter conische buizen.Sediment de monsters door centrifugatie. En meng 50 microliter enzym P uit een neurale weefseldissociatiekit met 1.900 microliter Buffer X uit de kit per monster. Verwarm het enzymmengsel minstens 10 minuten bij 37 graden Celsius.En de supernatant van elke weefselopvangbuis aanzuigen. Wanneer het enzymmengsel klaar is, voegt u 1,95 milliliter van de oplossing toe aan elk monster. En voorzichtig vortex om de pellets opnieuw op te schorten.Vervolgens, incubeer de monsters op een wiel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius, en meng 10 microliter van Enzym A met 20 microliters van Buffer Y per monster. Verwarm de tweede enzymoplossing voor op 37 graden Celsius, voordat u 30 microliter van de oplossing toevoegt aan elke weefseloplossing aan het einde van de schudden incubatie. Gebruik een 1.000 microliter pipettip, voorgespoeld met HPSS om elk monster voorzichtig te mengen.En breng de exemplaren 15 minuten terug aan het stuur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, arresteer de enzymatische reacties met 10 milliliter ijskoude HPSS. En sediment de monsters door centrifugatie.Aan het einde van de centrifugatie, opnieuw opschorten van de pellets in zeven milliliter van ijskoude HPSS per buis. En voorzichtig vortex elk monster, alvorens de buizen op ijs. Voor weefselhomogenisatie, voeg drie milliliter voorgekoelde HPSS aan de voorgekoelde glasmortel van een dounce weefselmolen, en breng de tweede helft van een van de geoogste hersenen of ruggenmergweefsel monsters naar de mortel.Macerate het weefsel voorzichtig met 10 slagen van Stamper A, gevolgd door 10 slagen van Pestle B.En breng het gehomogeniseerde mengsel over in een nieuwe 15 milliliter conische buis. Vul de buis tot een eindvolume van 10 milliliter met voorgekoelde HPSS voor centrifugatie. En bretel de pellet opnieuw in zeven milliliter verse HPSS met vortexing, voordat het monster op ijs wordt gehouden.Voor het verwijderen van puin, voeg drie milliliter van voorgekoelde isotone Percoll oplossing aan elk verteerd of gehomogeniseerd monster. En voorzichtig vortex de monsters om ervoor te zorgen dat ze homogeen gemengd. Vervolgens centrifugeren de monsters, en voorzichtig verwijderen van de witachtige schijf van puin en myeline drijvend op het oppervlak van de oplossing.Wanneer het puin is weggegooid, verzamelen alle, maar de laatste 100 microliter van de supernatant van elke buis zonder verstoring van de pellets. Schors elke pellet opnieuw in één milliliter FACS BL-oplossing voor overdracht in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Na deze integratie met de Percoll-oplossing is het belangrijk om de puinschijf en de supernatant zeer zorgvuldig te verwijderen zonder de celpellet los te maken om monsterverlies te voorkomen.Na centrifugatie, zorgvuldig aspirate de supernatant van elke buis, en opnieuw opschorten de pellets in 350 microliters van verse FACS BL per buis. Voor de stromingscytometrische analyse van de geïsoleerde celtypen, de monsters met vijf microgram per milliliter FC-blok per buis gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius uitbroeden alvorens het juiste antilichaam aan elke buis toe te voegen volgens het permanente protocol in de tabel. Vortex elke buis gedurende vijf seconden te mengen.En plaats de monsters op vier graden Celsius gedurende 15 minuten beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de monsters met een milliliter PBS per buis, en centrifuge. Schort de pellets opnieuw op in het juiste volume streptavidin per buis.Na vortexing te mengen, incubeer de monsters gedurende 10 minuten op vier graden celsius beschermd tegen licht. En was de cellen met een milliliter PBS per buis zoals aangetoond. Na het weggooien van de supernatants, opnieuw opschorten de pellets in 300 microliter verse FACS BL per buis.En label elk monster met vijf microliters van 7-AAD. Bewaar vervolgens de monsters op vier graden celsius beschermd tegen licht tot cytofluorometrische analyse. De homogenisatie methode produceert een hogere cel opbrengst van zowel de hersenen en het ruggenmerg in het algemeen, maar de meerderheid van de cellen opgehaald zijn meestal dood, wat resulteert in slechts en een ongeveer 14%genezen van levensvatbare cellen uit de hersenen, en een ongeveer 10% genezen van het ruggenmerg.In tegenstelling, de papaïne spijsvertering methode resulteert in een algehele betere behoud van cellulaire levensvatbaarheid. Analyse van de hersenen en ruggenmergcel suspensies met een negen kleur bi-flow cytometrie, onthult de aanwezigheid van CD45 +CD11b + microglia, en macrofagen. En CD45+CD11b-lymfocyten in beide weefsels.De CD45-cel populaties kunnen dan worden gediscrimineerd op basis van hun positiviteit voor astrocyten, of oligodendrocyte markers, of ferional en endotheel oppervlak marker expressie. Met behulp van de homogenisatiemethode is tussen 32 en 38% van de levensvatbare cellen van hematopoietische oorsprong. Terwijl de enzymatische spijsverteringsmethode resulteert in de verwerving van een zeer grote fractie van een niet-hematopoietische CD45-cellen.Opmerkelijk is dat CD45+CD11b+microglia en macrofagen de meest voorkomende levensvatbare celfractie met de homogenisatiemethode vertegenwoordigen. De spijsverteringsmethode produceert echter een meer heterogene weergave van celtypen, waaronder astrocyten, oligodendrocyten, endotheelcellen en neuronen. Dit protocol is veelzijdig en kan worden gebruikt voor verschillende downstreamtoepassingen, zoals de kwantificering of isolatie van specifieke cellen subpopulaties, primaire cultuur of biochemische of RNA-sequencing-analyse.We hebben dit protocol geïmplementeerd om de genexpressie en functionele handtekeningen van verschillende CNS-populaties te beoordelen tijdens deze progressie, of na behandeling in een muismodel van endotrofische laterale sclerose.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Acute en chronische Tactile Sensory Testing na ruggenmergletsel bij ratten

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Een radio-telemetrische systeem om de cardiovasculaire functie bij ratten met Spinal Cord doorsnijding en embryonale neurale stamcellen Enten Monitor

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contrast Enhanced Imaging Ultrasound voor de Beoordeling van Spinal Cord Blood Flow in Experimentele Spinal Cord Injury

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Gelijktijdige PET / MRI beeldvorming Tijdens Mouse Cerebral hypoxie-ischemie

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Een Neonatale Mouse Spinal Cord Injury Compressie Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...