Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

מחקר זה מומן על ידי כספי הסטארט-up של בית החולים לילדים של בוסטון א יהושע, ALSA גרנט nr. 17-IIP-343 כדי לעשות זאת, והמשרד של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות באמצעות תוכנית המחקר טרשת לרוחב Amyotrophic תחת הפרס לא. W81XWH-17-1-0036 ל-שוטרים אנו מכירים DFCI זרימה Cysupport ליבה לתמיכה טכנית.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של דנה פרבר סרטן המכון (פרוטוקול מספר 16-024).
1. הכנת הפתרונות הדרושים לניסוי
<ol><li>הכינו את פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS) על ידי דילול של 10 x HBSS עם מים סטריליים. . לפני שתרגיע את הפתרון בקרח לפחות 25 מ ל של פתר...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח שיתוף טיהור וזרימה במקביל של חלק מתאי ה-CN הרלוונטיים ממוח העכבר וחוט השדרה. באופן מסורתי, ניתוחים היסטולוגיים הוחלו כדי לתאר את התפלגות חלקיקים או את היעילות התמרה של וקטורים ויראליות ב-cn5,13, או כדי לספק תובנות על שינויים מורפו...

ג'ין וטכנולוגיות משלוח התרופה (כגון וקטורים וקטורי חלקיקים) הפכו כלי רב עוצמה שניתן להחיל כדי להשיג תובנות טובות יותר על מסלולים מולקולריים ספציפיים שונה במחלות ניווניות ולפיתוח גישות טיפוליות חדשניות1,2,3. אופטימיזציה של כלים אלה מסתמך על כימות של: (1) את היקף החדירה בתוך ה-CN על נתיבי שונים של ניהול ו (2) פילוח של אוכלוסיות תאים ספציפיות. ניתוחים היסטלוגיים מוחלים בדרך כלל על הדמיה של הכתב הפלורסנט גנים או fluorescently אופן מתויג חלקיקים באזורים שונים של המרכז העצמי ועל פני סוגי תאים שונים, מזוהה על ידי כתמים חיסוני עבור סמנים תא ספציפיים4,5. למרות גישה זו מספקת מידע רב ערך על ההתפלגות הביומלית של הגן המנוהל או כלי משלוח התרופות, הטכניקה יכולה להיות גוזלת זמן עבודה אינטנסיבית מאז שהוא דורש: (1) קיבוע רקמות, הקפאה או פרפין-הטבעה וחותך; (2) כתמים עבור סמנים סלולריים ספציפיים לעתים דורשים אחזור אנטיגן; (3) רכישה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, אשר בדרך כלל מאפשר ניתוח של מספר מוגבל של סמנים שונים בתוך אותו ניסוי; (4) עיבוד תמונה כדי לאפשר קוונפיקציה נאותה של אות הריבית.
הפכה cy, להיות טכניקה בשימוש נרחב אשר מנצל סמני פלורסנט ספציפיים מאוד כדי לאפשר לא רק הערכה כמותית מהירה של פנוטיפים תא שונים בשעיות התא, מבוסס על הביטוי של אנטיגנים או משטחים, אלא גם מדידות תפקודית (g., שיעור של אפופטוזיס, התפשטות, ניתוח מחזור התא, וכו '). בידוד פיזי של תאים באמצעות פלורסנט מופעל מיון התא אפשרי גם, המאפשר במורד הזרם יישומים (למשל, תרבות התא, RNAseq, ניתוחים ביוכימיים וכו ') . שש,שבע,שמונה
המגון רקמה היא צעד קריטי הכרחי כדי לקבל השעיית תא בודד כדי לאפשר אמין ומלא להזרים הערכות בזרם הסייטומטרימטרי. שיטות שונות תוארו עבור למבוגרים רקמת המוח המגון, בעיקר עם המטרה לבודד תאים מיקרוגלייה9,10,11; הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי בשתי קטגוריות עיקריות: (1) דיסוציאציה מכנית, אשר משתמשת שחיקה או הטיית כוח באמצעות הומוגניד Dounce (DH) כדי לקרוע את התאים מתוך נישות שלהם וליצור הבולם הומוגניים באופן יחסי הולם התא היחיד, ו (2) העיכול האנזימטי, המסתמך על דגירה של נתחי רקמות טחון ב-37 ° c בנוכחות אנזימים בעלי חרדה, כגון טריפסין או פאפאין, העדפה על השפלה של המטריצה המגמטית ליצור השעיית תאים הומוגניים למדי12.
ללא קשר לשיטה מנוצל, צעד טיהור מומלץ לאחר המגון רקמות להסיר את המיאלין דרך צנטריפוגה על הדרגתי צפיפות או על ידי בחירה מגנטית9,12, לפני המעבר יישומים במורד הזרם.
כאן, אנו מתארים שיטת עיבוד רקמות מבוסס על העיכול פפאין (PD) ואחריו טיהור על הדרגתי צפיפות, אופטימיזציה כדי להשיג השעיות תא הטרוגנית קיימא ממוח העכבר או חוט השדרה באופן רגיש זמן ומתאים לזרימה cy, try. יתר על כן, אנו מתארים 9-צבע הפאנל cy, לנסות את האסטרטגיה שאימצנו במעבדה כדי לאפשר את האפליה הסימולטני של אוכלוסיות שונות של ה-CN, חי/מת תאים או חיוביות עבור כתבים פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק או צבע rhodamine. על-ידי החלת ניתוח זה של הזרימה, אנו יכולים להשוות שיטות שונות של עיבוד רקמות, כלומר, PD מול DH, מבחינת שימור הכדאיות התאית ותשואות של סוגי תאים שונים.
הפרטים שאנו מספקים במסמך זה יכולים להורות על החלטה על פרוטוקול המגון ושילוב הנוגדן לשימוש בלוח הזרימה cy, מבוסס על סוג תא (ים) מסוים של עניין וניתוח במורד הזרם (g., רגישות לטמפרטורה יישומים, מעקב אחר סמני פלורסנט ספציפיים, בתרבות חוץ גופית, ניתוחים פונקציונליים).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

ההתקדמות האחרונה ב וקטורים וקטוריים ומדעי הננו פתחו את הדרך לגישות חדשניות לקידום החקירה או לטיפול במערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, אופטימיזציה נוספת של טכנולוגיות אלה היה להפיק תועלת מהשיטות המאפשרות מהירה ולייעל את היקף מידת המיקוד הספציפי לתא על ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים בגוף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מנצל את התפוקה הגבוהה ואת יכולות ריבוב של זרימה cy, נסה לאפשר כימות ישירה של תת תאים שונים מבודדים ממוח העכבר או חוט השדרה, כלומר microglia/מקרופאגים, לימפוציטים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך, נוירונים ותאי אנדותל. אנו מיישמים גישה זו כדי להדגיש הבדלים קריטיים בין שתי שיטות הומוקות רקמות במונחים של התשואה התא, הכדאיות והקומפוזיציה. הדבר יכול להורות למשתמש לבחור את השיטה הטובה ביותר בהתאם לסוג התא (ים) של עניין וליישום הספציפי. שיטה זו אינה מתאימה לניתוח של התפלגות אנטומית, שכן הרקמה היא הומוגניים כדי ליצור השעיה תא בודד. עם זאת, הוא מאפשר לעבוד עם תאים קיימא והוא יכול להיות משולב עם מיון תאים, פתיחת הדרך עבור מספר יישומים שיכולים להרחיב את הרפרטואר של כלים בידיים של נוירומדען, החל הקמת התרבויות הראשיות נגזר אוכלוסיות תאים טהורים, לניתוח גנים ביטוי ביוכימיים או פונקציונלי מוגדר על תת-מוגדרים היטב תאים בהקשר של מחלות ניווניות, על טיפול תרופתי או טיפול גנטי.

השוונו שתי שיטות שונות של הומוגון (DH נגד PD) להחיל על המוח העכבר ואת חוט השדרה, כדי לבדוק את היעילות באחזור סוגי תאים שונים קיימא מתאים ליישומי מטה. כדי לעשות זאת, אנו מנצלים 9-צבע הפאנל cy, לנסות לאפיין, במדגם זהה, סוגים שונים של תאי ה-CN הכוללים microglia, לימפוציטים, נוירונים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך ו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

אנו מציגים שיטת הזרמה cy, כדי לזהות בו סוגי תאים שונים שאוחזרו ממוח העכבר או חוט השדרה. שיטה זו יכול להיות מנוצל כדי לבודד או לאפיין אוכלוסיות תאים טהורה במחלות ניווניות או לכמת את היקף המיקוד של התא על vivo ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים.

אפיון מרובה של סוגי תאים שאוחזרו ממוח העכבר/חוט השדרה דרך שיטות הומוקות שונות

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

הפיתוח של כלים סלקטיביים לאספקת גנים ותרופות לטיפול בהפרעות נוירודגנרטיביות, דורש כימות ואפיון של מיקוד תאים, עם ניהול מחדש, או וקטורים ויראליים, או חלקיקים. יש להם תפוקה ויכולות multiplexing של ציטומטריית זרימה, מאפשר זיהוי פשוט בו זמנית של סוגי תאים מרובים ממוח העכבר וחוט השדרה. הדגמת ההליך תהיה פרנסיסקו חוויאר מולינה אסטבז, פוסט-דוקטורט מהמעבדה של אלכסנדר.לאחר קצירת המוח וחוט השדרה מעכבר C57 Black 6 בן שמונה שבועות, מניחים את הרקמות לתוך בארות בודדות של צלחת שש בארות, המכיל שני מיליליטר של קרח קר HPSS ל הבאר על קרח. מחלקים כל רקמה שנקטפו לשתי חתיכות שוות. ולהשתמש במספריים כדי לטחון חצי מכל דגימת רקמה לחתיכות בעובי של 1-2 מ"מ.כאשר כל הרקמות כבר מקוטע, מראש לשטוף שונה 1, 000 טיפ פיפטה microliter ב HPSS, ולהשתמש פיפטה להעביר כל השעיית רקמה לתוך צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר. שטפו את בארות עם שני מיליליטר נוספים של HPSS ל באר. ולמשוך את הכביסה בצינורות חרוט 15 מיליליטר המתאימים.תבזבז את הדגימות על ידי צנטריפוגה. ומערבבים 50 מיקרוליטרים של Enzyme P מערכת דיסוציאציה של רקמה עצבית עם 1,900 מיקרוליטרים של Buffer X מההערכה לכל דגימה. מחממים את תערובת האנזים ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות.ושואפים את העל-טבעי מכל צינור איסוף רקמות. כאשר תערובת האנזים מוכנה, מוסיפים 1.95 מיליליטר של הפתרון לכל מדגם. ובעדינות מערבולת להשעות מחדש את כדורי.לאחר מכן, דגירה הדגימות על גלגל במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים 10 microliters של אנזים A עם 20 microliters של מאגר Y לכל מדגם. לפני המלחמה פתרון האנזים השני ב 37 מעלות צלזיוס, לפני הוספת 30 microliters של הפתרון לכל פתרון רקמה בסוף הדגירה רועדת. השתמשו בקצה פיפסה של 1,000 מיקרוליטר, שטוף מראש ב-HPSS כדי לערבב בעדינות כל דגימה.ולהחזיר את הדגימות לגלגל במשך 15 דקות ב37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, עצרו את התגובות האנזימטיות עם 10 מיליליטר של HPSS קר כקרח. ולהרוס את הדגימות על ידי צנטריפוגה.בסוף הצנטריפוגה, להשעות מחדש את כדורי בשבעה מיליליטר של HPSS קר כקרח לכל צינור. ובעדינות מערבולת כל דגימה, לפני מחזיק את הצינורות על קרח. להומוגניזציה של רקמות, הוסיפו שלושה מיליליטר של HPSS מקורר מראש למרגמת הזכוכית המצונן מראש של מטחנה לרקמות מנוקד, והעבר את החצי השני של אחת מדגימות רקמת המוח או חוט השדרה שנקטפו למרגמה.בעדינות macerate את הרקמה עם 10 משיכות של עלה A, ואחריו 10 משיכות של עלה B.ולהעביר את התערובת הומוגנית לתוך צינור חרוט חדש 15 מיליליטר. מלא את הצינור לנפח סופי של 10 מיליליטר עם HPSS מקורר מראש עבור צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את גלולה בשבעה מיליליטר של HPSS טרי עם מערבולת, לפני מחזיק את המדגם על קרח.להסרת פסולת, הוסיפו שלושה מיליליטר של תוסף פרקול איזוטוני מקורר מראש לכל מדגם מתעכל או הומוגני. ובעדינות מערבולת הדגימות כדי לוודא שהם מעורבבים הומוגנית. לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות, בזהירות להסיר את הדיסק לבנבן של פסולת ומילין צף על פני השטח של הפתרון.כאשר הפסולת הושלכה, לאסוף את כל אבל האחרון 100 microliters של supernatant מכל צינור מבלי להפריע כדורי. להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של פתרון FACS BL להעברה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר. לאחר אינטגרציה זו עם פתרון פרקול, חשוב להסיר את דיסק הפסולת ואת supernatant בזהירות רבה מבלי לסלק את גלולת התא כדי למנוע אובדן מדגם.לאחר צנטריפוגה, בזהירות שאף את supernatant מכל צינור, ולהשעות מחדש את כדורי 350 microliters של FACS טרי BL לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של סוגי התאים המבודדים, הדגירה את הדגימות עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של בלוק FC לצינור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני הוספת הנוגדן המתאים לכל צינור על פי פרוטוקול העמידה המתואר בטבלה. מערבולת כל צינור במשך חמש שניות לערבב.ומ מניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות מוגנות מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של PBS לכל צינור, צנטריפוגה. להשעות מחדש את כדורי בנפח המתאים של סטרפטבידין לכל צינור.לאחר מערבולת לערבב, הדגירה את הדגימות במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS לצינור כפי שהודגם. לאחר השלכת supernatants, להשעות מחדש את כדורי 300 microliters של FACS טרי BL לכל צינור.ולתייג כל דגימה עם חמישה מיקרוליטרים של 7-AAD. לאחר מכן לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד ניתוח cytofluorometric. שיטת ההומוגניזציה מייצרת תפוקת תאים גבוהה יותר הן מהמוח והן מהחוט השדרה באופן כללי, אך רוב התאים שאוחזרו מתים בדרך כלל, וכתוצאה מכך רק כ -14% נרפאו של תאים בני קיימא מהמוח, וכ -10% נרפאו בחוט השדרה.לעומת זאת, שיטת עיכול הפפאין מביאה לשימור כללי טוב יותר של הכדאיות התאית. ניתוח של מתלי תאי המוח וחוט השדרה עם ציטומטריה דו-זרימה בצבע תשעה צבעים, חושף את נוכחותם של CD45+CD11b+microglia, ומאקרופאגים. ו CD45+CD11b-לימפוציטים בשתי הרקמות.לאחר מכן ניתן להפלות את אוכלוסיות תאי ה- CD45 בהתאם החיוביות שלהן עבור אסטרוציטים, או סמני אוליגודנדרוציטים, או ביטוי סמן פני שטח פראי ו אנדותל. באמצעות שיטת הומוגניזציה, בין 32 ל 38% של התאים קיימא הם ממוצא hematopoietic. בעוד שיטת העיכול האנזימטית גורמת לרכישת חלק גדול מאוד של CD45-תאים שאינם hematopoietic.למרבה הפלא, CD45+CD11b+microglia ומאקרופאגים מייצגים את שבר התא הנפוץ ביותר בשיטת ההומוגניזציה. שיטת העיכול, לעומת זאת, מייצרת ייצוג הטרוגני יותר של סוגי תאים כולל אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים, תאי אנדותל ותאי עצב. פרוטוקול זה הוא רב-תכליתי, והוא יכול להיות מנוצל עבור מספר יישומים במורד הזרם כגון כימות או בידוד של תאים ספציפיים subpopulations, התרבות העיקרית, או ביוכימי, או ניתוח רצף RNA.יישמנו פרוטוקול זה כדי להעריך את ביטוי הגנים וחתימות תפקודיות של אוכלוסיות שונות של מערכת העצבים המרכזית במהלך התקדמות זו, או לאחר טיפול במודל עכבר של טרשת נפוצה צידית אנדוטרופית.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

אקוטי וכרוני בדיקה חושי טקטילי לאחר פגיעה בחוט השדרה של חולדות

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

מערכת רדיו-telemetric לפקח פונקצית לב וכלי דם אצל חולדות עם חוט השדרה חיתוך רוחב ועוברי גזע עצבי שתלי סלולארי

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

השווה אולטראסאונד הדמיה משופרת להערכה של חוט השדרה זרימת דם בפגיעה בחוט השדרה הניסויית

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

ההדמיה PET / MRI בו זמנית בעכבר מוחין היפוקסיה-איסכמיה

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

חוט השדרה עכבר בילוד דגם פגיעה דחיסה

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...