Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
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この研究は、ボストン小児病院のスタートアップ資金によってA.B.、ALSA助成金nrに資金提供されました。17-IIP-343からM.P.、および筋萎縮性側索硬化症研究プログラムを通じて国防次官補室賞No.W81XWH-17-1-0036 から M.P.DFCIフローサイトメトリーコアの技術サポートを認めます。

ここで説明するすべての方法は、ダナ・ファーバー癌研究所(プロトコル番号16-024)の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 実験に必要なソリューションの準備
<ol><li>10x HBSSを滅菌水で希釈して、1xハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)を調製します。氷の上で溶液を事前に冷やします。各サンプルには少なくとも25mLの溶液が必要です。</li>
	<li>10...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

ここでは、マウス脳および脊髄からの最も関連性の高いCNS細胞の共精製および同時フローサイトメトリック分析のためのプロトコルについて説明する。従来、組織学的解析は、CNS5、13におけるナノ粒子の分布またはウイルスベクターの伝達効率を記述するために適用されてきたが、病理学または薬理学的治療14の間に特定の細胞型...

遺伝子および薬物送達技術(ウイルスベクターやナノ粒子など)は、神経変性疾患で変化した特定の分子経路に関するより良い洞察を得るために、および革新的な治療アプローチの開発のために適用することができる強力なツールとなっています。これらのツールの最適化は、定量化に依存します: (1) 管理の異なる経路上の CNS の浸透の程度と (2) 特定の細胞集団のターゲティング.組織学的解析は、通常、異なるCNS領域および異なる細胞型にわたって蛍光レポーター遺伝子または蛍光タグ付きナノ粒子を可視化するために適用され、特定の細胞マーカー4、5に対する免疫染色によって同定される。このアプローチは、投与された遺伝子または薬物送達ツールの生体分布に関する貴重な情報を提供しますが、(1)組織固定、凍結保存またはパラフィン埋め込みおよびスライスが必要なため、この技術は時間がかかり、手間がかかがあります。(2)特定の細胞マーカーの染色は、時には抗原検索を必要とする;(3)蛍光顕微鏡による取得は、通常、同じ実験内の限られた数の異なるマーカーの分析を可能にする。(4)画像処理により、目的の信号を適切に定量化できるようにする。
フローサイトメトリーは、非常に特異的な蛍光マーカーを利用して、表面または細胞内抗原の発現に基づいて細胞懸濁液中の異なる細胞表現型の迅速な定量的評価を可能にするだけでなく、機能的測定(例えば、アポトーシスの速度、増殖、細胞周期分析など)を可能にする広く使用されている技術となっています。蛍光活性化細胞選別による細胞の物理的分離も可能であり、さらなる下流用途(例えば、細胞培養、RNAseq、生化学的分析など)6、7、8。
組織均質化は、信頼性が高く再現性のある下流フローサイトメトリック評価を可能にするために、単一細胞懸濁液を得るために必要な重要なステップです。成人脳組織均質化には、主にミクログリア細胞9、10、11を単離することを目的として、異なる方法が記載されている。それらは、(1)ダウンスホモジナイザー(DH)を介して粉砕またはせん断力を使用してニッチから細胞を分離し、比較的均質化された単一細胞懸濁液を形成する機械的解離の2つの主要なカテゴリーに分類することができ、 (2)酵素消化は、トリプシンまたはパパインなどのタンパク質分解酵素の存在下で37°Cでのミンチ組織塊のインキュベーションに依存し、細胞外マトリックスの分解を支持し、かなり均質化された細胞懸濁液12を作成する。
どの方法が利用されているかに関係なく、組織均質化後に精製工程を行い、密度勾配の遠心分離を通してミエリンを除去するか、磁気選択9、12を経下流アプリケーションに移すことをお勧めします。
ここでは、パパイン消化(PD)に基づく組織処理方法を説明し、続いて密度勾配を精製し、マウス脳または脊髄から生存可能な異種細胞懸濁液を時間感受性の方法で得るように最適化し、フローサイトメトリーに適した。さらに、9色のフローサイトメトリーパネルと、我々は、異なるCNS集団、生死細胞または緑色蛍光タンパク質やロダミン色素などの蛍光レポーターのための陽性の同時判別を可能にするために実験室で採用したゲーティング戦略を説明します。このフローサイトメトリック分析を適用することにより、異なる細胞の生存率および異なる細胞タイプの収率の保存の観点から、組織処理の異なる方法、すなわちPD対DHを比較することができる。
本明細書で提供される詳細は、目的の特定の細胞タイプと下流分析(例えば、温度感受性)に基づいて、フローサイトメトリーパネルで使用する均質化プロトコルと抗体の組み合わせに関する決定を指示することができますアプリケーション、特定の蛍光マーカーの追跡、インビトロ培養、機能分析)。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

ウイルスベクターおよびナノマテリアル科学の最近の進歩は、中枢神経系(CNS)を調査または操作するための新しい最先端のアプローチの道を開きました。しかし、これらの技術のさらなる最適化は、体内のウイルスベクターまたはナノ粒子の投与におけるCNSおよび細胞特異的ターゲティングの程度の迅速かつ合理化的な決定を可能にする方法から利益を得るであろう。ここでは、フローサイトメトリーの高スループットと多重化機能を利用して、マウス脳または脊髄から分離された異なる細胞サブタイプ、すなわちミクログリア/マクロファージ、リンパ球、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよび内皮細胞を簡単に定量することを可能にするプロトコルを提示する。このアプローチを適用して、細胞収率、生存率、組成の観点から2つの組織均質化方法間の重要な違いを強調する。これにより、対象のセルの種類と特定のアプリケーションに応じて最適な方法を選択するようにユーザーに指示できます。この方法は、組織が単細胞懸濁液を生成するために均質化されているので、解剖学的分布の分析には適さない。しかし、それは生存可能な細胞と組み合わせることができ、それは、純粋な細胞集団に由来する一次培養の確立から、神経変性疾患の文脈でよく定義された細胞サブタイプに対する遺伝子発現解析や生化学的または機能的アッセイに至るまで、神経科学者の手でツールのレパートリーを拡大することができるいくつかのアプリケーションのための道を開く、細胞ソートと組み合わせることができます。

マウスの脳と脊髄に適用される2つの異なる均質化方法(DH対PD)を比較し、下流のアプリケーションに適した異なる生存細胞タイプを取得する際の効率をテストしました。そのために、ミクログリア、リンパ球、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮を含む異なるCNS細胞型を特徴付けるように設計された9色フローサイトメトリーパネルを利用しました。
<p class="jove_conten...

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Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

神経変性疾患を治療するための選択的遺伝子および薬物送達ツールの開発には、細胞標的化の定量化および特性評価、再投与時、またはウイルスベクター、またはナノ粒子が必要である。それらは流れのサイトメトリーの多重性および多重化機能を有し、マウスの脳および脊髄からの複数の細胞タイプの簡単で、同時の識別を可能にする。手順を実証するフランシスコ・ハビエル・モリーナ・エステベス, アレクサンダー研究所のポストドキュメント.生後8週間のC57ブラック6マウスから脳と脊髄を採取した後、氷の上の井戸あたり2ミリリットルの氷冷HPSSを含む6ウェルプレートの個々の井戸に組織を入れる。収穫した各組織を2つの等しい部分に分けます。そして、各組織サンプルの半分を1〜2ミリメートルの厚さにミンチするためにはさみを使用してください。すべての組織が断片化されたら、HPSSで改変された1,000マイクロリットルピペットチップをプレリンスし、ピペットを使用して各組織懸濁液を個々の15ミリリットルの円錐管に移す。井戸ごとにHPSSの追加の2ミリリットルで井戸をすすい。そして、対応する15ミリリットルの円錐管でのすきを引っ張ります。遠心分離によりサンプルを沈下する。そして、サンプル当たりのキットから1,900マイクロリットルのバッファXと神経組織解離キットから酵素Pの50マイクロリットルを混合します。酵素ミックスを摂氏37度で少なくとも10分間温めます。そして各組織採取管から上清を吸引する。酵素混合物の準備ができたら、各サンプルに溶液の1.95ミリリットルを追加します。そして、ペレットを再中断するために穏やかに渦。次に、ホイール上のサンプルを摂氏37度で15分間インキュベートし、10マイクロリットルの酵素Aを1サンプル当たり20マイクロリットルのバッファーYと混合します。2番目の酵素溶液を摂氏37度で予熱し、振盪インキュベーションの終わりに各組織溶液に30マイクロリットルの溶液を加える前に。HPSSでプレリンスした1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、各サンプルを穏やかに混合します。そして、37°Cで15分間ホイールに標本を戻します。インキュベーションの終わりに、氷冷HPSSの10ミリリットルで酵素反応を逮捕する。そして遠心分離によってサンプルを沈下する。遠心分離の終わりに、チューブあたり7ミリリットルの氷冷HPSSでペレットを再懸濁する。そして、氷の上にチューブを保持する前に、各サンプルを穏やかに渦。組織均質化の場合は、冷やしたHPSSを、日当りのある組織グラインダーの前チルガラスモルタルに3ミリリットル加え、収穫された脳または脊髄組織サンプルの1つの後半をモルタルに移す。10ストロークのペスレAで組織を穏やかに浸漬し、続いて10ストロークのペストルB.を新しい15ミリリットル円錐形チューブに移します。チューブを10ミリリットルの最終体積に、遠心分離のためにあらかじめ冷やしたHPSSで満たします。そして、氷の上にサンプルを保持する前に、渦を持つ新鮮なHPSSの7ミリリットルでペレットを再中断します。破片除去の場合は、消化または均質化されたサンプルごとに、冷やされた等張性パーコール溶液を3ミリリットル加えます。そして、サンプルが均一に混合されていることを確認するために、サンプルを穏やかに渦巻きます。次に、サンプルを遠心分離し、溶液の表面に浮かぶ破片およびミエリンの白っぽい円盤を慎重に取り除く。破片が廃棄されたら、ペレットを邪魔することなく、各チューブから上澄みの最後の100マイクロリットルを除くすべてを収集します。個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移すFACS BL溶液の1ミリリットルの各ペレットを再中断します。Percollソリューションとの統合後、サンプル損失を避けるために細胞ペレットを取り外すことなく、非常に慎重に破片ディスクと上澄を除去することが重要です。遠心分離後、各チューブから上清を慎重に吸引し、1管当たり350マイクロリットルの新鮮なFACS BLでペレットを再懸濁します。単離された細胞タイプのフローサイトメトリック解析の場合、表に概説されている定常プロトコルに従って各チューブに適切な抗体を加える前に、チューブ当たりFCブロック当たり5マイクログラムのFCブロックを摂氏4度で10分間インキュベートします。各チューブを5秒間渦を混ぜ合わせます。そして、光から保護された15分間、サンプルを摂氏4度に置きます。インキュベーションの終わりに、チューブあたり1ミリリットルのPBSと遠心分離機でサンプルを洗浄します。チューブ当たりのストレプトアビジンの適切な量でペレットを再中断します。混合するボルテックスの後、光から保護された摂氏4度で10分間サンプルをインキュベートします。そして、実証されているように、チューブあたりPBSの1ミリリットルで細胞を洗います。上清を捨て、チューブあたり300マイクロリットルの新鮮なFACS BLでペレットを再懸濁します。そして、各サンプルに7-AADの5マイクロリットルのラベルを付けます。次に、光から保護された4°Cで、細胞蛍光測定分析までサンプルを保存します。ホモジナイゼーション法は、脳と脊髄の両方からより高い細胞収量を生成するが、取り出される細胞の大部分は、典型的には死んでしまい、その結果、脳から生じる細胞の治癒は約14%であり、約10%は脊髄から治癒する。対照的に、パパイン消化法は、細胞生存率の全体的により良い保存をもたらす。9色のバイフローサイトメトリーを用いた脳および脊髄細胞懸濁液の分析は、CD45+CD11b+ミクログリア、およびマクロファージの存在を明らかにする。そして、両方の組織のCD45 +CD11bリンパ球。CD45細胞集団は、その後、アストロサイト、オリゴデンドロサイトマーカー、またはフェリオンおよび内皮表面マーカー発現の陽性に従って識別することができる。均質化法を用いて、生存細胞の32〜38%が造血起源である。酵素消化法は非造血性CD45細胞の非常に大きな割合の取得をもたらす一方で.驚くべきことに、CD45+CD11b+ミクログリアおよびマクロファージは、均質化法を用いた最も豊富な生存細胞分率を表す。しかし、消化法は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮細胞、ニューロンを含む細胞タイプのより異種的な表現を生み出す。このプロトコルは汎用性が高く、特定の細胞の亜集団の定量化または単離、一次培養、生化学的、RNAシーケンシング分析など、いくつかの下流アプリケーションに利用される可能性があります。我々は、この進行の間、または内視鏡的側索硬化症のマウスモデルにおける治療後に、異なるCNS集団の遺伝子発現および機能的シグネチャを評価するためにこのプロトコルを実施した。

Research

JoVE Journal

Medicine

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