Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
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이 연구는 A.B., ALSA 교부금 nr에 보스턴 아동 병원 창업 기금에 의해 투자되었습니다. 17-IIP-343에서 M.P.에, 그리고 상 번호에 따라 근위축성 측삭 경화증 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실. W81XWH-17-1-0036 ~ M.P. 우리는 기술 지원을 위해 DFCI 흐름 세포 측정 코어를 인정합니다.

여기에 설명된 모든 방법은 다나 파버 암 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다(프로토콜 번호 16-024).
1. 실험에 필요한 솔루션 준비
<ol><li>멸균수로 10x HBSS를 희석하여 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 1회 준비합니다. 용액을 얼음에 미리 식힙니다. 각 샘플에 대해 최소 25mL의 용액이 필요합니다.</li>
	<li>10x 멸균 HBSS 1:10을 밀도 그라데이션 ?...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

본 명세서에서 우리는 마우스 뇌 및 척수로부터 가장 관련성이 높은 CNS 세포의 일부의 동시 정제 및 동시 유동 세포측정 분석을 위한 프로토콜을 기술한다. 전통적으로, 조직학 분석은 CNS5,13에서바이러스 벡터의 나노입자 또는 트랜스덕션 효율의 분포를 설명하거나, 병리학 또는 약리학적 치료 시 특정 세포 유형에서 발생하는 형태학적 및 분자 변화에...

유전자 및 약물 전달 기술(예: 바이러스 벡터 및 나노입자)은 신경 퇴행성 질환에서 변경된 특정 분자 경로에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 혁신적인 치료 접근법의개발을 위해 적용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다1,2,3. 이러한 도구의 최적화는 정량화에 의존합니다: (1) 다른 투여 경로에 대한 CNS의 침투 범위 및 (2) 특정 세포 집단의 표적화. 조직학적 분석은 일반적으로 특정 세포마커4,5에대한 면역 염색에 의해 확인된 다른 CNS 지역 및 상이한 세포 모형에 있는 형광 리포터 유전자 또는 형광 태그나노입자를 구상하기 위하여 적용됩니다. 이 접근법은 투여된 유전자 또는 약물 전달 도구의 생체 분포에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 이 기술은 (1) 조직 고정, 동결 보존 또는 파라핀 삽입 및 슬라이스를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 노동이 강렬할 수 있다; (2) 때로는 항원 검색을 필요로 하는 특정 세포 마커에 대한 염색; (3) 형광 현미경 검사법에 의한 획득, 이는 일반적으로 동일한 실험 내에서 제한된 수의 다른 마커의 분석을 가능하게 한다; (4) 관심 있는 신호를 적절히 정량화할 수 있도록 이미지 처리.
유세포 분석은 표면 또는 세포 내 항원의 발현에 기초하여 세포 현탁액에서 다른 세포 표현형의 신속한 정량적 평가뿐만 아니라 기능적 측정 (예를 들어, 세포 사멸의 속도, 증식, 세포 주기 분석 등)를 허용하기 위해 매우 특이적 형광 마커를 활용하는 널리 사용되는 기술이되었습니다. 형광 활성화 세포 선별을 통한 세포의 물리적 분리도 가능하여 추가다운스트림 응용(예: 세포 배양, RNAeq, 생화학 적 분석 등)을 허용합니다. 6,7,8.
조직 균질화는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 하류 유동 세포 측정 평가를 허용하기 위해 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 중요한 단계입니다. 다른 방법은 성인 뇌 조직 균질화를 위해 설명되었으며, 주로 미세 글리아 세포를 분리하는 것을 목표로9,10,11; 그들은 전반적으로 두 가지 주요 범주로 분류 될 수있다 : (1) Dounce 균질화 (DH)를 통해 연삭 또는 전단력을 사용하여 틈새 에서 세포를 찢어 상대적으로 균질화 된 단일 세포 현탁액을 형성하는 기계적 해리, 및 (2) 효소 소화는 37°C에서 다진 조직 덩어리의 인큐베이션에 의존하며, 트립신 또는 파파인과 같은 단백질 분해 효소의 존재, 상당히 균질화된 세포현탁액(12)을생성하기 위해 세포외 매트릭스의 분해를 선호한다.
어떤 방법을 활용하든, 정화 단계는 조직 균질화 후 밀도 구배 또는 자기 선택9,12에의해 원심분리를 통해 미엘린을 제거하기 위해 하류 응용 프로그램으로 이동하기 전에 권장됩니다.
여기서, 우리는 파파인 소화(PD)에 기초한 조직 처리 방법을 설명하고 밀도 구도에 대한 정제를 거쳐, 시간 민감성 방식으로 마우스 뇌 또는 척수로부터 생존 가능한 이기종 세포 현탁액을 얻기 위해 최적화되고 유세포 분석에 적합하다. 또한, 우리는 녹색 형광 단백질 또는 로다민 염료와 같은 형광 기자를 위한 다른 CNS 인구, 살아있는/죽은 세포 또는 양성의 동시 적인 차별을 허용하기 위하여 실험실에서 채택한 9 색 교류 세포 측정 위원회 및 게이팅 전략을 기술합니다. 이 유동 세포 측정 분석을 적용함으로써, 우리는 조직 처리의 다른 방법을 비교할 수 있습니다, 즉, PD 대 DH, 세포 생존력과 다른 세포 유형의 수율의 보존측면에서.
본 명세서에서 당사가 제공하는 세부 사항은 관심 있는 특정 세포 유형 및 다운스트림 분석(예를 들어, 온도 민감성)에 기초하여 유세포측정 패널에서 사용하는 균질화 프로토콜 및 항체 조합에 대한 결정을 지시할 수 있다. 특정 형광 마커 추적, 시험관 내 배양, 기능 분석).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

바이러스 벡터 및 나노 물질 과학의 최근 발전은 중추 신경계를 조사하거나 조작하는 새로운 최첨단 접근법 (CNS)의 길을 열었습니다. 그러나, 이러한 기술의 추가 최적화는 체내에서 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 투여 시 CNS 및 세포 별 표적화의 정도를 신속하고 능률적인 측정을 허용하는 방법의 혜택을 누릴 것입니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌 또는 척수, 즉 microglia/대식세포, 림프세포, 성상세포, 올리고덴드로세포, 올리고덴드로소이트, 내피 세포에서 분리된 상이한 세포 아류형의 간단한 정량화를 허용하기 위해 유세포분석의 높은 처리량 및 다중화 기능을 활용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 세포 수율, 생존력 및 조성의 관점에서 두 조직 균질화 방법 사이의 중요한 차이점을 강조하기 위해이 방법을 적용합니다. 이렇게 하면 사용자가 관심 있는 셀 유형 및 특정 응용 프로그램에 따라 최상의 방법을 선택하도록 지시할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직이 균질화되기 때문에 해부학 적 분포의 분석에 적합하지 않습니다. 그러나, 그것은 가능한 세포로 작동할 수 있고, 순수한 세포 인구에서 파생된 1 차적인 배양의 설치에서, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석학에 구역 수색하는 신경과학자의 손에 있는 공구의 레퍼토리를 확장할 수 있는 몇몇 응용을 위한 방법을 여는 세포 분류와 결합될 수 있습니다.

우리는 마우스 뇌와 척수에 적용된 두 가지 균질화 방법(DH 대 PD)을 비교하여 다운스트림 애플리케이션에 적합한 다양한 생존 세포 유형을 검색하는 효율성을 테스트했습니다. 이를 위해, 우리는 마이크로글리아, 림프구, 뉴런, 성상 세포, 올리고덴드로시테 및 내피를 포함한 다른 CNS 세포 유형을 특성화하도록 설계된 9 색 유동 세포 분석 패널을 이용했습니다.
뇌 및 척수 조?...

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Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 선택적 유전자 및 약물 전달 도구의 개발은, 세포 표적화의 정량화 및 특성화를 요구하며, 재투여 시, 또는 바이러스 벡터, 또는 나노입자. 그들은 유세포 측정의 처리량 및 멀티플렉스 기능을 가지고 있으며, 마우스 뇌와 척수에서 여러 세포 유형을 간단하고 동시에 식별할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 알렉산더 연구소의 포스트 닥터인 프란시스코 하비에르 몰리나 에스테베스입니다.8주된 C57 Black 6 마우스에서 뇌와 척수를 수확한 후, 얼음 위에 잘 얼음으로 차가운 HPSS 2밀리리터가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 우물에 조직을 배치합니다. 수확한 각 조직을 두 개의 동등한 조각으로 나눕니다. 가위를 사용하여 각 조직 샘플의 절반을 1~2밀리미터 두께의 조각으로 다진다.모든 조직이 단편화되면 HPSS에서 수정된 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 미리 헹구고 파이펫을 사용하여 각 조직 현탁액을 개별 15 밀리리터 원문 튜브로 옮기습니다. 우물당 2밀리리터를 추가로 헹구면 우물을 헹구어 보입니다. 그리고 해당 15 밀리리터 원판 튜브에서 세초를 당깁니다.원심분리에 의한 샘플을 퇴적시합니다. 그리고 신경 조직 해리 키트에서 효소 P 50 마이크로리터를 샘플 당 키트에서 버퍼 X 1, 900 마이크로리터와 혼합합니다. 효소 믹스를 섭씨 37도에서 적어도 10분간 데우습니다.그리고 각 조직 수집 튜브에서 슈퍼 나티를 흡인. 효소 혼합물이 준비되면 각 샘플에 1.95 밀리리터의 용액을 추가하십시오. 그리고 부드럽게 소용돌이가 다시 펠릿을 중단합니다.다음으로, 휠의 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 효소 A의 마이크로리터 10을 샘플당 버퍼 Y 20 마이크로리터와 혼합합니다. 두 번째 효소 용액을 섭씨 37도에서 미리 떼어내면 흔들리는 배양 끝에 각 조직 용액에 30 마이크로리터를 추가합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 HPSS로 미리 헹구어 각 샘플을 부드럽게 혼합합니다.그리고 37섭씨에서 15분 동안 시편을 휠로 되돌려 보입니다. 인큐베이션이 끝나면 얼음처럼 차가운 HPSS 10밀리리터로 효소 반응을 체포합니다. 그리고 원심분리에 의한 샘플을 퇴적시한다.원심분리가 끝나면 튜브당 7밀리리터의 얼음-차가운 HPSS로 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 얼음에 튜브를 들고 전에, 부드럽게 각 샘플을 소용돌이. 조직 균질화를 위해, 미리 냉각된 HPSS의 3밀리리터를 투온스 조직 분쇄기의 미리 차가운 유리 박격포에 추가하고 수확한 뇌 또는 척수 조직 샘플 중 하나의 후반을 박격포로 옮긴다.부드럽게 페슬 A의 10 스트로크로 조직을 메이케레이트, 다음 10 페슬 B.의 스트로크와 새로운 15 밀리리터 원판 튜브로 균질화 혼합물을 전송. 원심분리를 위해 미리 냉각된 HPSS로 10밀리리터의 최종 부피로 튜브를 채웁니다. 그리고 얼음에 샘플을 개최하기 전에, 소용돌이와 신선한 HPSS의 일곱 밀리리터에 펠릿을 다시 중단합니다.이물질 제거의 경우, 소화된 각 시료 또는 균질화된 각 시료에 미리 냉각된 동위원 용액 3밀리리터를 추가합니다. 그리고 샘플을 부드럽게 소용돌이쳐 균일하게 혼합되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 샘플을 원심 분리하고, 조심스럽게 용액의 표면에 떠있는 파편과 myelin의 희끄무레한 디스크를 제거합니다.파편이 버려지면 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에서 수퍼나티의 마지막 100 마이크로리터를 제외한 모든 것을 수집하십시오. 개별 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 전송하기 위해 FACS BL 솔루션의 1 밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다. Percoll 솔루션과의 통합 후, 샘플 손실을 피하기 위해 셀 펠릿을 손상시키지 않고 파편 디스크와 상체를 매우 신중하게 제거하는 것이 중요합니다.원심 분리 후 각 튜브에서 상류체를 조심스럽게 흡인하고 튜브 당 350 마이크로 리터의 펠릿을 다시 중단하십시오. 격리된 세포 유형의 유량 세포 측정 분석을 위해, 표에 설명된 서 프로토콜에 따라 각 튜브에 적절한 항체를 추가하기 전에 튜브당 FC 블록당 5마이크로그램의 샘플을 4도에서 10분 동안 배양한다. 혼합하는 5 초 동안 각 튜브를 소용돌이.그리고 빛으로부터 보호 15 분 동안 섭씨 4도에 샘플을 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 튜브 당 PBS의 1 밀리리터와 원심 분리기로 샘플을 씻어. 튜브 당 스트렙타비딘의 적절한 부피에서 펠릿을 다시 중단합니다.소용돌이가 섞인 후, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그리고 입증 된 바와 같이 튜브 당 PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻어. 수퍼네이츠를 폐기한 후, 튜브당 300마이크로리터의 펠릿을 다시 중단한다.그리고 7-AAD의 5 개의 마이크로 리터로 각 샘플을 라벨. 그런 다음 시토플루오로메트릭 분석까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 균질화 방법은 전체적으로 뇌와 척수 모두에서 더 높은 세포 수율을 생성하지만, 검색 된 세포의 대부분은 일반적으로 죽었으며 뇌에서 실행 가능한 세포의 약 14 %가 치유되고 척수에서 약 10 %가 치유됩니다.대조적으로, 파팡 소화 방법은 세포 생존성의 전반적인 더 나은 보존귀착됩니다. 9색 이중유 세포측정을 가진 뇌 및 척수 세포 현탁액을 분석하면 CD45+CD11b+microglia 및 대식세포의 존재를 알 수 있습니다. 그리고 두 조직에서 CD45+CD11b-림프구.CD45 세포 인구는 성상세포, 또는 올리고덴드로시테 마커, 또는 야피및 내피 표면 마커 발현에 대한 양성에 따라 차별될 수 있다. 균질화 방법을 사용하여, 실행 가능한 세포의 32 ~38%는 조혈 기원이다. 효소 소화 방법은 비 조혈 CD45 세포의 매우 큰 분수의 획득을 초래하는 동안.놀랍게도, CD45+CD11b+마이크로글리아 및 대식세포는 균질화 방법을 사용하여 가장 풍부한 실행 가능한 세포 분획을 나타냅니다. 그러나 소화 방법은 성상세포, 올리고덴드로키테, 내피 세포 및 뉴런을 포함한 세포 유형의 보다 이질적인 표현을 생성합니다. 이 프로토콜은 다재다능하며 특정 세포 하위 집단, 1차 배양 또는 생화학적 또는 RNA 염기분석과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에 대해 악용될 수 있다.우리는 이 진행 도중 또는 내위축성 측삭 경화증의 마우스 모형에 있는 처리 후에, 또는 다른 CNS 인구의 유전자 발현 그리고 기능적인 서명을 평가하기 위하여 이 프로토콜을 실행했습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

쥐의 척수를 다친 후에 급성 및 만성 촉각 감각 테스트

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

연구

의학

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

무선 원격 측정 시스템은 척수 절개 및 배아 신경 세포 이식 줄기와 흰쥐의 심장 혈관 기능을 모니터링 할 수

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

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마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

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Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

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Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

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차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...