Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Denne studien ble finansiert av Boston Children ' s Hospital oppstart midler til A.B., ALSA Grant nr. 17-via-343 til M.P., og kontoret til assisterende forsvarsminister for helsedirektoratet gjennom amyotrofisk lateral sklerose Research program under Award nr. W81XWH-17-1-0036 til M.P. Vi erkjenner DFCI Flow flowcytometri Core for teknisk støtte.

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Dana Farber Cancer Institute (Protokollnummer 16-024).
1. utarbeidelse av løsninger som trengs for eksperimentet
<ol><li>Forbered 1x Hank ' s balansert saltløsning (HBSS) ved å fortynne 10x HBSS med sterilt vann. Pre-chill løsningen på isen. Minst 25 mL oppløsning er nødvendig for hver prøve.</li>
	<li>Forbered isoton Percoll oppløsning (IPS) ved å blande 10x steril HBSS ...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

Heri beskriver vi en protokoll for co-rensing og samtidig flyt analytiske analyse av noen av de mest relevante CNS celler fra mus hjernen og ryggmargen. Tradisjonelt har histologiske analyser blitt brukt for å beskrive fordelingen av nanopartikler eller den Transduction effektiviteten til virale vektorer i CNS5,13, eller for å gi innsikt om morfologiske og molekylære endringer som forekommer i bestemte celletyper under en patologi eller ved farmakologisk behan...

Gen-og legemiddel leveranse teknologi (som viral vektorer og nanopartikler) har blitt et kraftig verktøy som kan brukes til å få bedre innsikt i spesifikke molekylære baner som er endret i nevrodegenerative sykdommer og for utvikling av innovative terapeutiske tilnærminger1,2,3. Optimalisering av disse verktøyene er avhengig av kvantifisering av: (1) omfanget av penetrasjon i CNS på ulike administrasjonsveier og (2) målretting av bestemte celle populasjoner. Histologiske analyser brukes vanligvis for å visualisere fluorescerende reporter gener eller fluorescensmerkete nanopartikler i ulike CNS-områder og på tvers av ulike celletyper, identifisert av immunostaining for bestemte celle markører4,5. Selv om denne tilnærmingen gir verdifull informasjon om biodistribusjon av det administrerte genet eller medikament leveringsverktøy, kan teknikken være tidkrevende og arbeidsintensiv, siden den krever: (1) vev fiksering, kryonisk bevaring eller parafin-innebygging og kutting; (2) farging for spesifikke cellulære markører noen ganger krever antigen henting; (3) oppkjøp av fluorescens mikroskopi, som vanligvis tillater analyse av et begrenset antall forskjellige markører i samme eksperiment; (4) bildebehandling for å tillate riktig kvantifisering av signalet av interesse.
Flow flowcytometri har blitt en mye brukt teknikk som utnytter svært spesifikke fluorescerende markører for å tillate ikke bare en rask kvantitativ evaluering av ulike celle fenotyper i celle suspensjoner, basert på uttrykk for overflate eller intracellulære antigener, men også funksjonelle målinger (f. eks, rate av apoptose, spredning, celle syklus analyse, etc.). Fysisk isolering av celler gjennom fluorescerende aktivert celle sortering er også mulig, slik at ytterligere nedstrøms anvendelser (f. eks cellekultur, RNAseq, biokjemiske analyser osv.) 6,7,8.
Tissue homogenisering er et kritisk trinn som er nødvendig for å oppnå en enkelt celle suspensjon for å tillate pålitelig og reproduserbar nedstrøms flyt analytiske evalueringer. Ulike metoder har blitt beskrevet for voksne Brain-tissue homogenisering, hovedsakelig med sikte på å isolere mikroglia celler9,10,11; de kan være samlet klassifisert i to hovedkategorier: (1) mekaniske dissosiasjon, som bruker sliping eller skjærkraft gjennom en Dounce homogenisator (DH) for å rippe hverandre celler fra sine nisjer og danner en relativt homogenisert enkelt celle fjæring, og (2) enzymatisk fordøyelse, som er avhengig av inkubasjons av hakket vev biter på 37 ° c i nærvær av proteolytiske enzymer, slik som Trypsin eller Papain, favoriserer degradering av ekstracellulære matrise for å skape en ganske homogenisert celle suspensjon12.
Uavhengig av hvilken metode som benyttes, er en rensing trinn anbefales etter vev homogenisering å fjerne myelin gjennom sentrifugering på en tetthet gradient eller ved magnetisk valg9,12, før han flyttet til nedstrøms programmer.
Her beskriver vi en vev prosesseringsmetode basert på Papain fordøyelse (PD) etterfulgt av rensing på en tetthet gradient, optimalisert for å få levedyktig heterogen celle suspensjoner fra mus hjernen eller ryggmargen i en tid-følsom måte og egnet for flyt flowcytometri. Videre beskriver vi en 9-farge Flow flowcytometri panel og gating strategien vi vedtatt i laboratoriet for å tillate samtidig diskriminering av forskjellige CNS populasjoner, Live/døde celler eller positivitet for fluorescerende journalister som grønt fluorescerende protein eller rhodamine fargestoff. Ved å anvende denne flyten analytiske analyse, kan vi sammenligne ulike metoder for vevs behandling, dvs., PD versus DH, i form av bevaring av mobilnettet levedyktighet og gir av ulike celletyper.
Detaljene vi gir her kan instruere vedtak om homogenisering protokollen og antistoff kombinasjon til bruk i Flow flowcytometri panel, basert på den spesifikke celletypen (e) av interesse og nedstrøms analyser (f. eks temperaturfølsomme applikasjoner, sporing av spesifikke fluorescerende markører, in vitro-kultur, funksjonelle analyser).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

Nylige fremskritt i viral vektor og nanomaterialebasert vitenskaper har åpnet veien for nye cutting-edge tilnærminger til å undersøke eller manipulere sentralnervesystemet (CNS). Men ytterligere optimalisering av disse teknologiene vil dra nytte av metoder som tillater rask og effektivisere fastsettelse av omfanget av CNS og celle-spesifikk målretting ved administrering av viral vektorer eller nanopartikler i kroppen. Her presenterer vi en protokoll som utnytter den høye gjennomstrømningen og multipleksing evnene til flyt flowcytometri for å tillate en grei kvantifisering av forskjellige celle under typer isolert fra mus hjernen eller ryggmargen, nemlig mikroglia/makrofager, lymfocytter, astrocytter, oligodendrocytes, neurons og endothelial celler. Vi bruker denne tilnærmingen til å fremheve kritiske forskjeller mellom to vev homogenisering metoder i form av celle utbytte, levedyktighet og sammensetning. Dette kan instruere brukeren til å velge den beste metoden avhengig av celletypen (e) av interesse og det bestemte programmet. Denne metoden er ikke egnet for analyse av anatomiske fordelingen, siden vevet er homogenisert til å generere en enkelt celle suspensjon. Men det gjør det mulig å arbeide med levedyktige celler og det kan kombineres med celle-sortering, åpne veien for flere programmer som kan utvide repertoaret av verktøy i hendene på hjerneforsker, alt fra etablering av primær kulturer avledet fra ren celle populasjoner, til gen-uttrykk analyser og biokjemiske eller funksjonelle analyser på veldefinerte celle under typer i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer, ved farmakologisk behandling eller genterapi.

Vi sammenlignet to forskjellige homogenisering metoder (DH versus PD) brukes til mus hjernen og ryggmargen, for å teste effektiviteten i hente ulike levedyktige celletyper egnet for nedstrøms applikasjoner. For å gjøre dette, utnyttet vi en 9-farge Flow flowcytometri panel designet for å karakterisere, i samme prøve, ulike CNS celletyper inkludert mikroglia, lymfocytter, neurons, astrocytter, oligodendrocytes og endotelet.
Vevet i hjerne-og ryggmargen ble Hentet fra forskjellige mus (n ?...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Vi presenterer en Flow flowcytometri metode for å identifisere samtidig ulike celletyper Hentet fra mus hjernen eller ryggmargen. Denne metoden kan utnyttes til å isolere eller karakterisere rene celle populasjoner i nevrodegenerative sykdommer eller for å kvantifisere omfanget av celle målretting ved in vivo administrasjon av viral vektorer eller nanopartikler.

Samtidige Flow analytiske karakterisering av flere celletyper Hentet fra mus Brain/ryggmarg gjennom ulike homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Utviklingen av selektive gen- og legemiddelleveringsverktøy for å behandle nevrodegenerative lidelser, krever kvantifisering og karakterisering av cellemålretting, ved readministrasjon eller virale vektorer eller nanopartikler. De har gjennomstrømning og multipleksing evner flyt cytometri, tillater enkel og samtidig identifisering av flere celletyper fra musen hjernen og ryggmargen. Demonstrere prosedyren vil være Francisco Javier Molina Estevez, en post-doc fra Alexander's Laboratory.Etter å ha høstet hjernen og ryggmargen fra en åtte uker gammel C57 Black 6-mus, plasserer du vevet i individuelle brønner på en seksbrønns plate, som inneholder to milliliter iskalde HPSS per brønn på is. Del hvert høstet vev i to like stykker. Og bruk saks til å hakke halvparten av hver vevsprøve i en til to millimeter tykke stykker.Når alle vevene er fragmentert, må du forhåndsskylle en modifisert 1000 mikroliter pipettespiss i HPSS, og bruk pipetten til å overføre hver vevssuspensjon til individuelle koniske rør på 15 milliliter. Skyll brønnene med ytterligere to milliliter HPSS per brønn. Og trekk vaskene i de tilsvarende 15 milliliter koniske rørene.Sediment prøvene ved sentrifugering. Og bland 50 mikroliter av Enzyme P fra et nevrale vevdissosiasjonssett med 1900 mikroliter buffer X fra settet per prøve. Varm enzymblandingen ved 37 grader celsius i minst 10 minutter.Og aspirerer supernatanten fra hvert vevsamlingsrør. Når enzymblandingen er klar, tilsett 1,95 milliliter av løsningen til hver prøve. Og forsiktig vortex å re-suspendere pellets.Deretter inkuberer prøvene på et hjul i 15 minutter ved 37 grader celsius, og blander 10 mikroliter av enzym A med 20 mikroliter buffer Y per prøve. Forvarm den andre enzymløsningen ved 37 grader celsius, før du legger til 30 mikroliter av løsningen til hver vevsløsning på slutten av ristingsinkubasjonen. Bruk en pipettespiss på 1000 mikroliter, forskyllet med HPSS for å blande hver prøve forsiktig.Og sett prøvene tilbake til hjulet i 15 minutter ved 37 grader celsius. På slutten av inkubasjonen, arrester de enzymatiske reaksjonene med 10 milliliter iskalde HPSS. Og sediment prøvene ved sentrifugering.På slutten av sentrifugeringen, re-suspendere pellets i syv milliliter iskalde HPSS per rør. Og forsiktig virvle hver prøve, før du holder rørene på is. For vev homogenisering, tilsett tre milliliter av pre-kjølt HPSS til pre-kjølt glass mørtel av en dounce vevsliper, og overføre andre halvdel av en av de høstede hjernen eller ryggmargen vev prøver til mørtel.Macerate forsiktig vevet med 10 slag Pestle A, etterfulgt av 10 slag Pestle B.Og overfør den homogeniserte blandingen til et nytt 15 milliliter konisk rør. Fyll røret til et endelig volum på 10 milliliter med forhåndskjølt HPSS for sentrifugering. Og re-suspendere pellet i syv milliliter av ferske HPSS med vortexing, før du holder prøven på is.For fjerning av rusk, tilsett tre milliliter med pre-kjølt isotonisk Percoll-løsning til hver fordøyd eller homogenisert prøve. Og forsiktig virvle prøvene for å sikre at de er homogent blandet. Deretter sentrifuger prøvene, og fjern forsiktig den hvite skiven av rusk og myelin som flyter på overflaten av løsningen.Når ruskene er kassert, samle alle unntatt de siste 100 mikroliter av supernatant fra hvert rør uten å forstyrre pellets. Suspender hver pellet i ett milliliter FACS BL-løsning for overføring til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Etter denne integrasjonen med Percoll-løsningen, er det viktig å fjerne ruskskiven og supernatanten veldig nøye uten å løsne cellepelleten for å unngå prøvetap.Etter sentrifugering aspirerer du forsiktig supernatanten fra hvert rør, og re-suspendere pellets i 350 mikroliter av friske FACS BL per rør. For flow cytometrisk analyse av de isolerte celletyper, inkuber prøvene med fem mikrogram per milliliter FC blokk per rør i 10 minutter ved fire grader celsius før du legger riktig antistoff til hvert rør i henhold til den stående protokollen skissert i tabellen. Vortex hvert rør i fem sekunder for å blande.Og plasser prøvene på fire grader celsius i 15 minutter beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask prøvene med en milliliter PBS per rør, og sentrifuge. Re-suspendere pellets i riktig volum av streptavidin per rør.Etter vortexing å blande, inkuber prøvene i 10 minutter ved fire grader celsius beskyttet mot lys. Og vask cellene med en milliliter PBS per rør som demonstrert. Etter å ha kastet supernativane, må du suspendere pelletsene i 300 mikroliter frisk FACS BL per rør.Og merk hver prøve med fem mikroliter på 7-AAD. Oppbevar deretter prøvene ved fire grader celsius beskyttet mot lys til cytofluormetrisk analyse. Homogeniseringsmetoden gir et høyere celleutbytte fra både hjernen og ryggmargen generelt, men de fleste cellene som hentes er vanligvis døde, noe som resulterer i bare og en ca 14% helbredet av levedyktige celler fra hjernen, og en ca 10% helbredet fra ryggmargen.I motsetning resulterer papain fordøyelsesmetoden i en generell bedre bevaring av cellulær levedyktighet. Analyse av hjernen og ryggmargscellesuspensjoner med en ni farge bi-flow cytometri, avslører tilstedeværelsen av CD45 + CD11b + microglia, og makrofager. Og CD45 +CD11b-lymfocytter i begge vev.CD45-cellepopulasjonene kan deretter diskrimineres i henhold til deres positivitet for astrocytt, eller oligodendrocyte markører, eller ferional og endoteloverflatemarkøruttrykk. Ved hjelp av homogeniseringsmetoden er mellom 32 og 38% av de levedyktige cellene av hematopoetisk opprinnelse. Mens den enzymatiske fordøyelsesmetoden resulterer i oppkjøpet av en svært stor brøkdel av en ikke-hematopoetisk CD45-celler.Bemerkelsesverdig representerer CD45 + CD11b + microglia og makrofager den mest rikelig levedyktige cellefraksjonen med homogeniseringsmetoden. Fordøyelsesmetoden produserer imidlertid en mer heterogen representasjon av celletyper, inkludert astrocytter, oligodendrocytter, endotelceller og nevroner. Denne protokollen er allsidig, og kan utnyttes for flere nedstrøms applikasjoner som kvantifisering eller isolering av bestemte celler underpopulasjoner, primær kultur, eller biokjemisk, eller RNA sekvensering analyse.Vi har implementert denne protokollen for å vurdere genuttrykket og funksjonelle signaturer fra forskjellige CNS-populasjoner under denne progresjonen, eller etter behandling i en musemodell av endoktrofisk lateral sklerose.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Akutt og kronisk Taktil Sensory Testing etter ryggmargsskade i Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Innsamling, Isolation, og flowcytometrisk analyse av menneskelige endocervikale prøver

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En Radio-telemetrisk system for å overvåke kardiovaskulær funksjon i rotter med ryggmargstran og Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Funksjonell karakterisering av Mouse Colorectal afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Kontrastforsterket ultralyd Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow i Experimental ryggmargsskade

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Samtidig PET / MR Imaging Under Mouse Cerebral Hypoksi-iskemi

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En organotypiske høy gjennomstrømning System for Karakterisering av Drug Sensitivity of Primary myelomatose Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...