Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
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Este estudio fue financiado por fondos de start-up del Boston Children's Hospital a A.B., ALSA grant nr. 17-IIP-343 a M.P., y la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación de Esclerosis Lateral Amiotrófica bajo el Premio No. W81XWH-17-1-0036 a M.P. Reconocemos DFCI Flow Cytometry Core para soporte técnico.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Dana Farber Cancer Institute (número de protocolo 16-024).
1. Preparación de las soluciones necesarias para el experimento
<ol><li>Prepare 1 solución salina equilibrada de Hank (HBSS) diluyendo 10x HBSS con agua estéril. Enfríe previamente la solución sobre hielo. Se necesitan al menos 25 ml de solución para cada muestra.</li>
	<li>Preparar la solución isotónic...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

Aquí describimos un protocolo para la co-purificación y el análisis citométrico de flujo simultáneo de algunas de las células del SNC más relevantes del cerebro del ratón y la médula espinal. Tradicionalmente, se han aplicado análisis histológicos para describir la distribución de nanopartículas o la eficiencia de transducción de vectores virales en el SNC5,13, o para proporcionar información sobre los cambios morfológicos y moleculares que se pro...

Las tecnologías de generación de genes y fármacos (como los vectores virales y las nanopartículas) se han convertido en una poderosa herramienta que se puede aplicar para obtener mejores perspectivas sobre vías moleculares específicas alteradas en enfermedades neurodegenerativas y para el desarrollo de enfoques terapéuticos innovadores1,2,3. La optimización de estas herramientas se basa en la cuantificación de: (1) el grado de penetración en el SNC en diferentes vías de administración y (2) la focalización de poblaciones celulares específicas. Los análisis histológicos se aplican generalmente para visualizar genes de reporterofluorescentes o nanopartículas etiquetadas fluorescentes en diferentes áreas del SNC y en diferentes tipos de células, identificados por inmunomanchado para marcadores celulares específicos4,5. A pesar de que este enfoque proporciona información valiosa sobre la biodistribución del gen administrado o las herramientas de administración de fármacos, la técnica puede ser lenta e intensa en el trabajo de parto, ya que requiere: (1) fijación de tejidos, criopreservación o incrustación y corte de parafina; (2) la tinción de marcadores celulares específicos que a veces requieren la recuperación de antígenos; 3) adquisición por microscopía de fluorescencia, que normalmente permite el análisis de un número limitado de marcadores diferentes dentro del mismo experimento; (4) procesamiento de imágenes para permitir una cuantificación adecuada de la señal de interés.
La citometría de flujo se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada que aprovecha marcadores fluorescentes muy específicos para permitir no sólo una evaluación cuantitativa rápida de diferentes fenotipos celulares en suspensiones celulares, basada en la expresión de antígenos superficiales o intracelulares, sino también mediciones funcionales (por ejemplo, tasa de apoptosis, proliferación, análisis del ciclo celular, etc.). El aislamiento físico de las células a través de la clasificación de células fluorescentes activadas también es posible, lo que permite aplicaciones posteriores (por ejemplo, cultivo celular, ARNseq, análisis bioquímicos, etc.) 6,7,8.
La homogeneización de tejidos es un paso crítico necesario para obtener una suspensión de una sola célula que permita evaluaciones citométricas de flujo descendente fiables y reproducibles. Se han descrito diferentes métodos para la homogeneización cerebro-tejido adulto, principalmente con el objetivo de aislar las células de microglia9,10,11; pueden clasificarse en general en dos categorías principales: (1) disociación mecánica, que utiliza la fuerza de molienda o cizallamiento a través de un homogeneizador de Dounce (DH) para separar las células de sus nichos y formar una suspensión de una sola célula relativamente homogeneizada, y (2) la digestión enzimática, que se basa en la incubación de trozos de tejido picado a 37 oC en presencia de enzimas proteolíticas, como la trippsina o la papaína, favoreciendo la degradación de la matriz extracelular para crear una suspensión celular bastante homogeneizada12.
Independientemente del método que se utilice, se recomienda un paso de purificación después de la homogeneización del tejido para eliminar la mielina a través de la centrifugación en un gradiente de densidad o por selección magnética9,12, antes de pasar a las aplicaciones aguas abajo.
Aquí, describimos un método de procesamiento de tejido basado en la digestión de la papaína (PD) seguido de purificación en un gradiente de densidad, optimizado para obtener suspensiones celulares heterogéneas viables del cerebro del ratón o de la médula espinal de una manera sensible al tiempo y adecuada para la citometría de flujo. Además, describimos un panel de citometría de flujo de 9 colores y la estrategia de gating que adoptamos en el laboratorio para permitir la discriminación simultánea de diferentes poblaciones de SNC, células vivas/muertas o positividad para reporteros fluorescentes como proteína fluorescente verde o tinte de rodamina. Mediante la aplicación de este análisis citométrico de flujo, podemos comparar diferentes métodos de procesamiento de tejido, es decir, PD frente a DH, en términos de preservación de la viabilidad celular y rendimientos de diferentes tipos de células.
Los detalles que proporcionamos aquí pueden instruir la decisión sobre el protocolo de homogeneización y la combinación de anticuerpos para utilizar en el panel de citometría de flujo, basado en el tipo de celda específico de interés y los análisis aguas abajo (por ejemplo, sensible a la temperatura seguimiento de marcadores fluorescentes específicos, cultivo in vitro, análisis funcionales).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

Los recientes avances en las ciencias de vectores virales y nanomateriales han abierto el camino a nuevos enfoques de vanguardia para investigar o manipular el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, una mayor optimización de estas tecnologías se beneficiaría de métodos que permitan determinar rápida y agilizar el alcance del SNC y la orientación específica de las células en la administración de vectores virales o nanopartículas en el cuerpo. Aquí, presentamos un protocolo que aprovecha las capacidades de alto rendimiento y multiplexación de la citometría de flujo para permitir una cuantificación directa de diferentes subtipos celulares aislados del cerebro del ratón o de la médula espinal, a saber, microglia/macrophages, linfocitos, astrocitos, oligodendrocitos, neuronas y células endoteliales. Aplicamos este enfoque para resaltar las diferencias críticas entre dos métodos de homogeneización tisular en términos de rendimiento celular, viabilidad y composición. Esto podría indicar al usuario que elija el mejor método dependiendo de los tipos de celda de interés y la aplicación específica. Este método no es adecuado para el análisis de la distribución anatómica, ya que el tejido se homogeneiza para generar una suspensión de una sola célula. Sin embargo, permite trabajar con células viables y se puede combinar con la clasificación celular, abriendo el camino para varias aplicaciones que podrían ampliar el repertorio de herramientas en manos del neurocientífico, que van desde el establecimiento de cultivos primarios derivados de poblaciones de células puras, hasta análisis de expresión génica y ensayos bioquímicos o funcionales sobre subtipos celulares bien definidos en el contexto de enfermedades neurodegenerativas, sobre el tratamiento farmacológico o la terapia génica.

Comparamos dos métodos de homogeneización diferentes (DH versus PD) aplicados al cerebro del ratón y la médula espinal, para probar la eficiencia en la recuperación de diferentes tipos de células viables adecuadas para aplicaciones posteriores. Para ello, explotamos un panel de citometría de flujo de 9 colores diseñado para caracterizar, en la misma muestra, diferentes tipos de células del SNC, incluyendo microglia, linfocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y endotelio.
Los t...

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Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Presentamos un método de citometría de flujo para identificar simultáneamente diferentes tipos de células recuperadas del cerebro del ratón o de la médula espinal. Este método podría ser explotado para aislar o caracterizar las poblaciones de células puras en enfermedades neurodegenerativas o para cuantificar el alcance de la orientación celular a la administración in vivo de vectores virales o nanopartículas.

Caracterización citométrica de flujo simultáneo de múltiples tipos de células recuperadas del cerebro del ratón/cordón espinal a través de diferentes métodos de homogeneización

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

El desarrollo de herramientas selectivas de administración de genes y fármacos para tratar los trastornos neurodegenerativos, requiere la cuantificación y caracterización de la focalización celular, tras la re-administración, o vectores virales, o nanopartículas. Tienen capacidades de rendimiento y multiplexación de citometría de flujo, permite la identificación directa y simultánea de múltiples tipos de células desde el cerebro del ratón y la médula espinal. Demostrar el procedimiento estará Francisco Javier Molina Estévez, un post-doc del Laboratorio alexander.Después de cosechar el cerebro y la médula espinal de un ratón C57 Black 6 de ocho semanas de edad, coloque los tejidos en pozos individuales de una placa de seis pozos, que contiene dos mililitros de HPSS helado por pozo en hielo. Divida cada tejido cosechado en dos trozos iguales. Y usa tijeras para picar la mitad de cada muestra de tejido en trozos de uno a dos milímetros de grosor.Cuando todos los tejidos se hayan fragmentado, enjuague previamente una punta de pipeta modificada de 1.000 microlitros en HPSS, y utilice la pipeta para transferir cada suspensión de tejido a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Enjuague los pozos con dos mililitros adicionales de HPSS por pozo. Y tire de los lavados en los tubos cónicos correspondientes de 15 mililitros.Sedimentar las muestras por centrifugación. Y mezcle 50 microlitros de Enzyme P de un kit de disociación de tejido neural con 1.900 microlitros de Buffer X del kit por muestra. Caliente la mezcla enzimática a 37 grados centígrados durante al menos 10 minutos.Y aspirar el sobrenadante de cada tubo de recolección de tejido. Cuando la mezcla enzimática esté lista, agregue 1,95 mililitros de la solución a cada muestra. Y suavemente vórtice para volver a suspender los pellets.A continuación, incubar las muestras en una rueda durante 15 minutos a 37 grados centígrados, y mezclar 10 microlitros de enzima A con 20 microlitros de buffer Y por muestra. Precalienta la segunda solución enzimática a 37 grados centígrados, antes de añadir 30 microlitros de la solución a cada solución tisular al final de la incubación del temblor. Utilice una punta de pipeta de 1.000 microlitros, pre-enjuagado con HPSS para mezclar suavemente cada muestra.Y devolver los especímenes a la rueda durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, detenga las reacciones enzimáticas con 10 mililitros de HPSS helado. Y sedimentar las muestras por centrifugación.Al final de la centrifugación, vuelva a suspender los pellets en siete mililitros de HPSS helado por tubo. Y atra vórtice suavemente cada muestra, antes de sostener los tubos sobre hielo. Para la homogeneización del tejido, agregue tres mililitros de HPSS preenfriado al mortero de vidrio preenfriado de una trituradora de tejido dounce, y transfiera la segunda mitad de una de las muestras de tejido cerebral o de la médula espinal cosechadas al mortero.Macerar suavemente el tejido con 10 golpes de Pestle A, seguido de 10 golpes de Pestle B.Y transferir la mezcla homogeneizada en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Llene el tubo hasta un volumen final de 10 mililitros con HPSS preenfriado para centrifugación. Y vuelva a suspender el pellet en siete mililitros de HPSS fresco con vórtice, antes de sostener la muestra sobre hielo.Para la eliminación de escombros, agregue tres mililitros de solución isotónica Pre-enfriada de Percoll a cada muestra digerida u homogeneizada. Y vórtice suavemente las muestras para asegurarse de que se mezclan homogéneamente. A continuación, centrifugar las muestras y retire cuidadosamente el disco blanquecino de escombros y mielina flotando en la superficie de la solución.Cuando los escombros hayan sido desechados, recoja todos los microlitros excepto los últimos 100 del sobrenadante de cada tubo sin molestar los pellets. Vuelva a suspender cada pellet en un mililitro de solución FACS BL para transferirlos a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros. Después de esta integración con la solución Percoll, es importante eliminar el disco de escombros y el sobrenadante con mucho cuidado sin desalojar el pellet celular para evitar la pérdida de la muestra.Después de la centrifugación, aspirar cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo, y volver a suspender los pellets en 350 microlitros de FACS BL fresco por tubo. Para el análisis citométrico de flujo de los tipos de células aisladas, incubar las muestras con cinco microgramos por mililitro de bloque FC por tubo durante 10 minutos a cuatro grados centígrados antes de añadir el anticuerpo adecuado a cada tubo de acuerdo con el protocolo permanente descrito en la tabla. Vórtice cada tubo durante cinco segundos para mezclar.Y coloque las muestras a cuatro grados centígrados durante 15 minutos protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave las muestras con un mililitro de PBS por tubo y centrífuga. Vuelva a suspender los pellets en el volumen adecuado de estreptavidina por tubo.Después de la mezcla de vórtices, incubar las muestras durante 10 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. Y lave las células con un mililitro de PBS por tubo como se ha demostrado. Después de desechar los sobrenadantes, vuelva a suspender los pellets en 300 microlitros de FACS BL fresco por tubo.Y etiquete cada muestra con cinco microlitros de 7-AAD. A continuación, almacene las muestras a cuatro grados centígrados protegidos de la luz hasta el análisis citofluorométrico. El método de homogeneización produce un mayor rendimiento celular tanto del cerebro como de la médula espinal en general, pero la mayoría de las células recuperadas suelen estar muertas, lo que resulta en una sola y un 14% sanada de células viables del cerebro, y aproximadamente 10% sanada de la médula espinal.Por el contrario, el método de digestión de la papaína resulta en una mejor preservación general de la viabilidad celular. El análisis de las suspensiones cerebrales y de la célula de la médula espinal con una citometría biflujo de nueve colores, revela la presencia de CD45+CD11b+microglia, y macrófagos. Y CD45+CD11b-linfocitos en ambos tejidos.Las poblaciones de células CD45 pueden ser discriminadas de acuerdo con su positividad para los marcadores de astrocitos u oligodendrocitos, o la expresión de marcadores de superficie ferional y endotelial. Utilizando el método de homogeneización, entre el 32 y el 38% de las células viables son de origen hematopoyético. Mientras que el método de digestión enzimática resulta en la adquisición de una fracción muy grande de una célula CD45 no hematopoyética.Sorprendentemente, CD45+CD11b+microglia y macrófagos representan la fracción celular viable más abundante con el método de homogeneización. El método de digestión, sin embargo, produce una representación más heterogénea de los tipos celulares, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos, células endoteliales y neuronas. Este protocolo es versátil y podría aprovecharse para varias aplicaciones posteriores, como la cuantificación o el aislamiento de subpoblaciones de células específicas, cultivo primario o análisis bioquímico o secuenciación de ARN.Hemos implementado este protocolo para evaluar la expresión génica y las firmas funcionales de diferentes poblaciones del SNC durante esta progresión, o después del tratamiento en un modelo de ratón de esclerosis lateral endotrófica.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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