Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Denna studie finansierades av Boston Children ' s Hospital start-up fonder till A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 till M.P., och kontoret för biträdande försvarsministern för hälsofrågor genom Amyotrofiska lateral skleros forsknings program under Award No. W81XWH-17-1-0036 till M.P. Vi erkänner DFCI Flow Cytometry Core för teknisk support.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Dana Farber Cancer Institute (protokollnummer 16-024).
1. beredning av lösningar som behövs för experimentet
<ol><li>Förbered 1x Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) genom att späda 10X HBSS med sterilt vatten. Pre-Chill lösningen på is. Minst 25 mL lösning behövs för varje prov.</li>
	<li>Förbered isotonisk Percoll lösning (IPS) genom att blanda 10X sterila HB...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

Häri beskriver vi ett protokoll för samrening och samtidig flödescytometrisk analys av några av de mest relevanta CNS-cellerna från mushjärna och ryggmärg. Traditionellt har histologiska analyser tillämpats för att beskriva distributionen av nanopartiklar eller verkningsgraden hos virala vektorer i CNS5,13, eller för att ge insikter om morfologiska och molekylära förändringar som förekommer i specifika celltyper under en patologi eller vid farmakolo...

Gen-och läkemedelsleverans teknik (såsom virusvektorer och nanopartiklar) har blivit ett kraftfullt verktyg som kan tillämpas för att få bättre insikter om specifika molekylära vägar förändrade i neurodegenerativa sjukdomar och för utveckling av innovativa terapeutiska metoder1,2,3. Optimering av dessa verktyg bygger på kvantifiering av: (1) omfattningen av penetration i CNS vid olika administreringsvägar och (2) inriktning av specifika cellpopulationer. Histologiska analyser används vanligtvis för att visualisera fluorescerande rapportgener eller fluorescerande-märkta nanopartiklar i olika CNS-områden och mellan olika celltyper, identifierade genom immunofärgning för specifika cell markörer4,5. Även om detta tillvägagångssätt ger värdefull information om biodistribution av den administrerade genen eller Drug-leveransverktyg, kan tekniken vara tidskrävande och arbetsintensiva eftersom det kräver: (1) vävnadsinfixering, kryopreservation eller paraffin-inbäddning och skivning; (2) färgning för specifika cellulära markörer ibland kräver antigen hämtning; (3) förvärv av fluorescensmikroskopi, som vanligtvis möjliggör analys av ett begränsat antal olika markörer inom samma experiment; (4) bildbehandling för att möjliggöra korrekt kvantifiering av signalen av intresse.
Flödescytometri har blivit en allmänt använd teknik som utnyttjar mycket specifika fluorescerande markörer för att möjliggöra inte bara en snabb kvantitativ utvärdering av olika cell fenotyper i cellsuspensioner, baserat på uttryck av yta eller intracellulära antigener, men också funktionella mätningar (t. ex. hastighet av apoptos, proliferation, cell cykel analys, etc.). Fysisk isolering av celler genom fluorescerande aktiverad cell sortering är också möjligt, vilket möjliggör ytterligare nedströms tillämpningar (t. ex. cellkultur, RNAseq, biokemiska analyser etc.) 6,7,8.
Vävnad homogenisering är ett kritiskt steg som krävs för att få en enda cellsuspension att möjliggöra tillförlitlig och reproducerbara nedströms flödescytometriska utvärderingar. Olika metoder har beskrivits för vuxna hjärnvävnad homogenisering, främst i syfte att isolera mikroglia celler9,10,11; de kan vara övergripande klassificeras i två huvudkategorier: (1) mekanisk dissociation, som använder slipning eller klippning kraft genom en Dounce Homogenisatorer (DH) att rippa isär celler från sina nischer och bildar en relativt homogeniserad enda cellsuspension, och (2) enzymatisk matsmältning, som förlitar sig på inkubation av malet vävnad bitar vid 37 ° c i närvaro av proteolytiska enzymer, såsom trypsin eller papain, gynnar nedbrytningen av den extracellulära matrisen för att skapa en ganska homogeniserad cellsuspension12.
Oavsett vilken metod som används, rekommenderas ett reningssteg efter vävnads homogenisering för att avlägsna myelin genom centrifugering på en densitetsgradient eller genom magnet val9,12, innan de övergår till nedströms applikationer.
Här beskriver vi en vävnads process metod baserad på papain matsmältningen (PD) följt av rening på en densitet gradient, optimerad för att få livskraftiga heterogena cellsuspensioner från mushjärna eller ryggmärg på ett tidskänsligt sätt och lämpar sig för flödescytometri. Dessutom beskriver vi en 9-färgton flödescytometri panel och den gating strategi vi antog i laboratoriet för att möjliggöra samtidig diskriminering av olika CNS populationer, levande/döda celler eller positivitet för fluorescerande reportrar såsom grönt fluorescerande protein eller rodamin färgämne. Genom att tillämpa denna flödescytometrisk analys kan vi jämföra olika metoder för vävnads bearbetning, dvs PD kontra DH, när det gäller bevarande av cellulär lönsamhet och utbyten av olika celltyper.
De uppgifter vi tillhandahåller häri kan instruera beslut om homogeniseringsprotokollet och antikropps kombinationen att använda i flödescytometri-panelen, baserat på den specifika celltypen (-erna) av intresse och efterföljande analyser (t. ex. temperaturkänsliga applikationer, spårning av specifika fluorescerande markörer, in vitro-kultur, funktionella analyser).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

De senaste framstegen inom viral Vector och nanomaterial har öppnat vägen för nya banbrytande metoder för att undersöka eller manipulera centralanervsystemet (CNS). Men ytterligare optimering av dessa tekniker skulle gynnas av metoder som möjliggör snabb och strömlinjeformad bestämning av omfattningen av CNS och cellspecifik inriktning vid administrering av virala vektorer eller nanopartiklar i kroppen. Här presenterar vi ett protokoll som utnyttjar den höga genomströmningen och multiplexering kapacitet flödescytometri att möjliggöra en enkel kvantifiering av olika cell subtyper isolerade från mushjärna eller ryggmärg, nämligen microglia/makrofager, lymfocyter, astrocyter, oligodendrocyter, nervceller och endotelceller. Vi tillämpar denna metod för att belysa kritiska skillnader mellan två vävnads homogenisering metoder när det gäller cell utbyte, lönsamhet och sammansättning. Detta kan instruera användaren att välja den bästa metoden beroende på celltyp (er) av intresse och det specifika programmet. Denna metod lämpar sig inte för analys av anatomisk fördelning, eftersom vävnaden är homogeniserad för att generera en encellig suspension. Men det gör det möjligt att arbeta med livskraftiga celler och det kan kombineras med cell-sortering, öppna vägen för flera applikationer som kan utöka repertoaren av verktyg i händerna på neuroscientist, alltifrån etablering av primära kulturer som härrör från ren cellpopulationer, till gen-Expression analyser och biokemiska eller funktionella analyser på väldefinierade cell subtyper i samband med neurodegenerativa sjukdomar, vid farmakologisk behandling eller genterapi.

Vi jämförde två olika homogeniseringsmetoder (DH kontra PD) appliceras på mushjärna och ryggmärg, att testa effektiviteten i att hämta olika livskraftiga celltyper som lämpar sig för nedströms applikationer. För att göra detta utnyttjade vi en 9-färgton flödescytometri panel som utformats för att karakterisera, i samma prov, olika CNS-celltyper inklusive microglia, lymfocyter, neuroner, astrocyter, oligodendrocyter och endotelet.
Vävnader från hjärnan och ryggmärgen hämtade...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Vi presenterar en flödescytometri metod för att identifiera samtidigt olika celltyper hämtas från mushjärna eller ryggmärg. Denna metod skulle kunna utnyttjas för att isolera eller karakterisera rena cellpopulationer i neurodegenerativa sjukdomar eller för att kvantifiera omfattningen av cell inriktningen vid in vivo-administrering av virala vektorer eller nanopartiklar.

Samtidig flödescytometrisk karakterisering av flera cell typer Hämtad från mushjärna/ryggmärg genom olika Homogeniseringsmetoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Utvecklingen av selektiva gen- och läkemedelstillförselverktyg för att behandla de neurodegenerativa sjukdomarna, kräver kvantifiering och karakterisering av cellinriktning, vid återadministration, eller virala vektorer, eller nanopartiklar. De har genomströmning och multiplexing kapacitet flödescytometri, gör det möjligt att enkla och samtidiga identifiering av flera celltyper från musen hjärnan och ryggmärgen. Visar förfarandet kommer att Francisco Javier Molina Estevez, en post-doc från Alexander's Laboratory.Efter skörd hjärnan och ryggmärgen från en åtta veckor gammal C57 Black 6 mus, placera vävnaderna i enskilda brunnar av en sex-brunn tallrik, som innehåller två milliliter iskall HPSS per brunn på is. Dela varje skördad vävnad i två lika stora bitar. Och använd sax för att finhacka ena halvan av varje vävnadsprov i en till två millimeter tjocka bitar.När alla vävnader har fragmenterats, förskölj en modifierad 1, 000 mikroliterpipettspets i HPSS, och använd pipetten för att överföra varje vävnadsupphängning till individuella 15 milliliter koniska rör. Skölj brunnarna med ytterligare två milliliter HPSS per brunn. Och dra tvättarna i motsvarande 15 milliliter koniska rör.Sediment proverna genom centrifugeringen. Och blanda 50 mikroliter av Enzym P från en neural vävnadsuppsällningssats med 1, 900 mikroliter av BufferT X från satsen per prov. Värm enzymblandningen vid 37 grader celsius i minst 10 minuter.Och aspirera supernatanten från varje vävnadssamlingsrör. När enzymblandningen är klar, tillsätt 1,95 milliliter av lösningen till varje prov. Och försiktigt virvel för att åter upphäva pellets.Därefter inkubera proverna på ett hjul i 15 minuter vid 37 grader celsius, och blanda 10 mikroliter enzym A med 20 mikroliter buffert Y per prov. Prewarm den andra enzymlösningen vid 37 grader celsius, innan du lägger till 30 mikroliter av lösningen till varje vävnadslösning i slutet av skakinkubationen. Använd en 1, 000 mikroliter pipett spets, försköljd med HPSS att försiktigt blanda varje prov.Och återför exemplaren till hjulet i 15 minuter vid 37 grader celsius. I slutet av inkubationen, arrestera enzymatiska reaktioner med 10 milliliter iskall HPSS. Och sediment proverna genom centrifugeringen.I slutet av centrifugeringen, åter upphäva pellets i sju milliliter iskall HPSS per rör. Och försiktigt virvel varje prov, innan du håller rören på is. För vävnad homogenisering, tillsätt tre milliliter av pre-kylda HPSS till pre-kylda glas murbruk av en dounce vävnad kvarn, och överföra den andra halvan av en av de skördade hjärnan eller ryggmärgen vävnadsprover till murbruk.Macerate försiktigt vävnaden med 10 slag av Pestle A, följt av 10 slag av Pestle B.Och överför den homogeniserade blandningen till ett nytt 15 milliliter koniskt rör. Fyll röret till en slutvolym på 10 milliliter med förkyld HPSS för centrifugering. Och åter avbryta pelleten i sju milliliter färsk HPSS med virvel, innan du håller provet på is.För borttagning av skräp, tillsätt tre milliliter av prekyld isoton Percoll-lösning till varje smält eller homogeniserat prov. Och försiktigt virvelproverna för att se till att de är homogent blandade. Därefter centrifugerna proverna, och försiktigt ta bort vitaktig skiva av skräp och myelin flyter vid ytan av lösningen.När skräpet har kasserats, samla alla utom de sista 100 mikroliter av supernatanten från varje rör utan att störa pellets. Återuppstäng varje pellet i en milliliter FACS BL-lösning för överföring till individuella 1,5 milliliter mikrocentrifugrör. Efter denna integration med Percoll-lösningen är det viktigt att ta bort skräpskivan och supernatanten mycket försiktigt utan att lossa cellpelletsen för att undvika provförlust.Efter centrifugeringen aspirera noggrant supernatanten från varje rör, och åter upphäva pellets i 350 mikroliter av färska FACS BL per rör. För flödescytometrisk analys av de isolerade celltyperna inkubera proverna med fem mikrogram per milliliter FC-block per rör i 10 minuter vid fyra grader celsius innan lämplig antikropp tillsätts till varje rör enligt det stående protokoll som beskrivs i tabellen. Vortex varje rör i fem sekunder för att blanda.Och placera proverna på fyra grader celsius i 15 minuter skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta proverna med en milliliter PBS per rör, och centrifug. Åter upphäva pellets i lämplig volym av streptavidin per rör.Efter virvelning att blanda, inkubera proverna i 10 minuter vid fyra grader celsius skyddad från ljus. Och tvätta cellerna med en milliliter PBS per rör som visats. Efter att du har kastat supernatanterna, åter upphäva pellets i 300 mikroliter av färska FACS BL per rör.Och märka varje prov med fem mikroliter av 7-AAD. Sedan lagra proverna på fyra grader celsius skyddas från ljus tills cytofluormetrisk analys. Homogeniseringsmetoden ger en högre cellutbyte från både hjärnan och ryggmärgen totalt, men majoriteten av de celler som hämtas är vanligtvis döda, vilket resulterar i endast och en cirka 14%läkt av livskraftiga celler från hjärnan, och en cirka 10%läkt från ryggmärgen.Däremot resulterar papain digestion metoden i en övergripande bättre bevarande av cellulära livskraft. Analys av hjärnan och ryggmärgen cell suspensioner med en nio färg bi-flöde cytometri, avslöjar förekomsten av CD45 + CD11b + microglia och makrofager. Och CD45+CD11b-lymfocyter i båda vävnaderna.CD45-cell populationer kan sedan diskrimineras enligt deras positivitet för astrocyte, eller oligodendrocyte markörer, eller ferional och endotel yta markör uttryck. Med hjälp av homogeniseringsmetoden är mellan 32 till 38%av de livskraftiga cellerna av hematopoiiskt ursprung. Medan den enzymatiska digestion metoden resulterar i förvärvet av en mycket stor del av en icke-hematopoietiska CD45-celler.Anmärkningsvärt nog representerar CD45+CD11b+mikroglia och makrofager den mest förekommande livskraftiga cellfraktionen med homogeniseringsmetoden. Digestion metoden, dock producerar en mer heterogen representation av celltyper inklusive astrocyter, oligodendrocytes, endotelceller, och nervceller. Detta protokoll är mångsidig, och skulle kunna utnyttjas för flera nedströms applikationer såsom kvantifiering eller isolering av specifika celler subpopulationer, primär kultur, eller biokemiska, eller RNA sekvensering analys.Vi har genomfört detta protokoll för att bedöma genuttryck och funktionella signaturer av olika CNS populationer under denna progression, eller efter behandling i en mus modell av endotrofa lateral skleros.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Akut och kronisk Taktil Sensorisk Provning efter ryggmärgsskada hos råttor

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Insamling, Isolering och flödescytometrisk analys av Human endocervikala prover

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En radio-telemetri system för att övervaka hjärtfunktionen hos råttor med ryggmärgstransection och embryonala Neural Stem Cell Transplantat

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Funktionell karakterisering av mus kolorektal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Kontrastförstärkt ultraljud Imaging för Bedömning av ryggmärgs blodflöde i experimentell Ryggmärgsskada

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Samtidig PET / MR Imaging Under Mouse Cerebral Hypoxi-ischemi

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...