Name: simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods
Uploaded: 2019-11-19T01:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Bu çalışma Boston Çocuk Hastanesi start-up fonları a.b., ALSA hibe nr tarafından finanse edilmiştir. 17-IIP-343 M.P., ve Ödül No altında Aminotrofik Lateral Skleroz Araştırma Programı ile Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi. W81XWH-17-1-0036'dan M.P.'ye. Teknik destek için DFCI Flow Cytometry Core'u kabul ediyoruz.

Burada açıklanan tüm yöntemler Dana Farber Kanser Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 16-024).
1. Deney için gerekli çözümlerin hazırlanması
<ol><li>10x HBSS'yi steril suyla seyrelterek 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın. Çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutun. Her numune için en az 25 mL çözelti gereklidir.</li>
	<li>10x steril HBSS 1:10'u yoğunluk gradyan ortamla (yani Perco...

<ol>
	<li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+neurological+disorders:+progress+and+prospects.">Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).</li><li>Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterials+for+Drug+Delivery+to+the+Central+Nervous+System.">Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System.</a> Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Viral+Vectors+as+Neuroscience+Tools.">Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools.</a> Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).</li><li>Alves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy+as+a+novel+tool+to+unravel+the+tropism+of+AAV+gene+therapy+vectors+in+the+brain.">Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain.</a> Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+carrying+enhancer+elements+of+Hb9+promoter+drive+selective+transgene+expression+in+mouse+spinal+cord+motor+neurons.">Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).</li><li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping.">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li><li>Sykora, M. M., Reschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+of+Tissue+Samples+Using+Multicolor+Flow+Cytometry.">Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).</li><li>Legroux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+process+mouse+CNS+to+simultaneously+analyze+neural+cells+and+leukocytes+by+flow+cytometry.">An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).</li><li>Lee, J. K., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Isolation+from+Adult+Mouse+Brain.">Microglia Isolation from Adult Mouse Brain.</a> Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).</li><li>Grabert, K., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Phenotyping+of+Adult+Mouse+Microglial+Cells.">Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).</li><li>Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+mouse+microglial+cells.">Isolation and analysis of mouse microglial cells.</a> Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).</li><li>Papa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Nanovector+Mediated+Treatment+of+Activated+Proinflammatory+Microglia/Macrophages+in+Spinal+Cord+Injury.">Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury.</a> ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+the+Sigma-1+receptor+(S1R)+agonist+PRE-084,+in+a+mouse+model+of+motor+neuron+disease+not+linked+to+SOD1+mutation.">Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation.</a> Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).</li><li>Peviani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+administered+in+the+cerebrospinal+fluid:+Brain+biodistribution,+preferential+internalization+in+microglia+and+implications+for+cell-selective+drug+release.">Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release.</a> Biomaterials. 209, 25-40 (2019).</li><li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD73-derived+adenosine+controls+inflammation+and+neurodegeneration+by+modulating+dopamine+signalling.">CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling.</a> Brain. 142 (3), 700-718 (2019).</li><li>Nedeljkovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+regulation+of+ecto-5'-nucleotidase/CD73+and+A2AR-mediated+adenosine+signaling+at+neurovascular+unit:+A+link+between+acute+and+chronic+neuroinflammation.">Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation.</a> Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).</li></ol>

Burada fare beyni ve omurilikten en alakalı CNS hücrelerinin eş saflaştırma ve eşzamanlı akış sitometrik analizi için bir protokol açıklıyoruz. Geleneksel olarak, histolojik analizler nano tanecikleri dağılımı veya CNS viral vektörlerin transdüksiyon verimliliği tanımlamak için uygulanmıştır5,13, veya bir patoloji sırasında veya farmakolojik tedavi üzerine belirli hücre tiplerinde meydana gelen morfolojik ve moleküler değişiklikler...

Gen ve ilaç dağıtım teknolojileri (viral vektörler ve nano tanecikleri gibi) nörodejeneratif hastalıklarda değiştirilmiş belirli moleküler yollar hakkında daha iyi anlayışlar elde etmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için uygulanabilir güçlü bir araç haline gelmiştir1,2,3. Bu araçların optimizasyonu, aşağıdakilerin nicelleştirilmesine dayanır: (1) CNS'deki penetrasyonun farklı yönetim yolları üzerindeki nüfuz derecesi ve (2) belirli hücre popülasyonlarının hedeflenmesi. Histolojik analizler genellikle floresan muhabir genleri veya floresan etiketli nano tanecikleri farklı CNS alanlarda ve farklı hücre tipleri arasında görselleştirmek için uygulanır, belirli hücre belirteçleri için immünboyama ile tanımlanan4,5. Bu yaklaşım, uygulanan genin veya ilaç dağıtım araçlarının biyodağıtımı hakkında değerli bilgiler sağlasa da, teknik zaman alıcı ve emek açısından yoğun olabilir: (1) doku fiksasyonu, kriyopreservation veya parafin katıştırma ve dilimleme; (2) bazen antijen alımı gerektiren belirli hücresel belirteçler için boyama; (3) floresan mikroskobu ile edinimi, genellikle aynı deney içinde farklı belirteçleri sınırlı sayıda analizi sağlar; (4) görüntü işleme ilgi sinyalinin doğru niceliksel izin vermek.
Akış sitometrisi, hücre süspansiyonlarında farklı hücre fenotiplerinin sadece yüzey veya hücre içi antijenlerin ekspresyonuna dayalı olarak hızlı bir nicel değerlendirmesine değil, aynı zamanda fonksiyonel ölçümlere (örn. apoptoz oranı, çoğalma, hücre döngüsü analizi vb.) olanak sağlamak için çok özel floresan belirteçlerden yararlanan yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelmiştir. Floresan aktif hücre ayrıştırma yoluyla hücrelerin fiziksel izolasyonu da mümkündür, daha fazla aşağı akım uygulamaları (örneğin, hücre kültürü, RNAseq, biyokimyasal analizler vb) izin 6,7,8.
Doku homojenizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir aşağı akım sitometrik değerlendirmeler sağlamak için tek bir hücre süspansiyon elde etmek için gerekli kritik bir adımdır. Farklı yöntemler yetişkin beyin dokusu homojenizasyonu için tarif edilmiştir, özellikle mikroglia hücreleri izole etmek amacıyla9,10,11; genel olarak iki ana kategoride sınıflandırılabilirler: (1) hücreleri nişlerinden ayırmak ve nispeten homojenleştirilmiş tek hücresüspansiyonu oluşturmak için bir Don homogenizer (DH) ile taşlama veya kesme kuvveti kullanan mekanik ayrışma, ve (2) enzimositsel sindirim, hangi 37 °C'de kin doku parçalarının kuluçka dayanır proteolitik enzimlerin varlığında, tripsin veya papain gibi, oldukça homojenleştirilmiş hücre süspansiyon oluşturmak için ekstrasellüler matris bozulması lehine12.
Hangi yöntemden ne olursa olsun, doku homojenizasyonundan sonra bir yoğunluk gradyan üzerinde santrifüj yoluyla miyelin ilerlediği veya manyetik seçimle 9,12, aşağı akım uygulamalarına geçmeden önce bir arınma adımı önerilir.
Burada, papain sindirimine dayalı bir doku işleme yöntemini (PH) ve ardından, fare beyninden veya omurilikten zamana duyarlı ve akış sitometrisine uygun olarak uygulanabilir heterojen hücre süspansiyonları elde etmek için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan üzerinde saflaştırmayı tanımlıyoruz. Ayrıca, 9 renkli akış sitometri paneli ve farklı CNS popülasyonları, canlı / ölü hücreler veya pozitiflik floresan muhabirler için yeşil floresan protein veya rhodamine boya gibi eşzamanlı ayrımcılık sağlamak için laboratuvarda kabul edilen gating stratejisi açıklar. Bu akış sitometrik analizini uygulayarak, hücresel canlılığın korunması ve farklı hücre tiplerinin verimleri açısından doku işleme yöntemlerini, yani PH ile DH'yi karşılaştırabiliriz.
Burada sağladığımız ayrıntılar, homojenizasyon protokolü ve akış sitometri panelinde kullanılacak antikor kombinasyonu hakkında, belirli hücre tipi(ler) ve akış analizlerine (örn. ısıya duyarlı) dayanarak karar verebilir. uygulamalar, spesifik floresan belirteçlerin takibi, in vitro kültür, fonksiyonel analizler).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-117-535</td>
			<td>APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>47-0112-82</td>
			<td>APC-eFluor 780 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562939</td>
			<td>BV421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td>Brilliant Violet 510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202518</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1005325</td>
			<td>PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (15 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes (50 mL)</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9063-1SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 anti mouse/rat/human antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-895</td>
			<td>Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10266569</td>
			<td>sold as not sterile reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>65455529</td>
			<td>sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-5445-01</td>
			<td>reagent containing very low traces of endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S3258</td>
			<td>Alexa Fluor 680 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous flow cytometric characterization of multiple cell types retrieved from mouse brain/spinal cord through different homogenization methods

Viral vektör ve nanomalzeme bilimlerinde son gelişmeler araştırmak veya merkezi sinir sistemi (CNS) işlemek için yeni üstün yaklaşımlar için önünü açmıştır. Ancak, bu teknolojilerin daha fazla optimizasyon cns ve vücutta viral vektörler veya nano tanecikleri uygulanması üzerine hücre özel hedefleme ölçüde hızlı ve aerodinamik belirlenmesine olanak sağlayan yöntemleryararlanacaktır. Burada, fare beyin veya omurilikten izole edilen farklı hücre alt tiplerinin, yani mikroglia/makrofajların, lenfositlerin, astrositlerin, oligodendrositlerin, nöronların ve endotel hücrelerinin basit bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamak için akış sitometrisinin yüksek üretim ve çoklama yeteneklerinden yararlanan bir protokol sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisini silyon ile karşılıyoruz. Bu yaklaşımı, hücre verimi, canlılık ve bileşim açısından iki doku homojenizasyon yöntemi arasındaki kritik farklılıkları vurgulamak için uyguluyoruz. Bu, kullanıcıya ilgi çeken hücre türüne ve belirli uygulamaya bağlı olarak en iyi yöntemi seçmesini sağlayabilir. Doku tek hücreli süspansiyon oluşturmak için homojenize olduğundan bu yöntem, anatomik dağılımın analizi için uygun değildir. Ancak, canlı hücrelerle çalışmaya olanak sağlar ve hücre ayrıştırma ile kombine edilebilir, saf hücre popülasyonlarından elde edilen birincil kültürlerin kurulmasından, gen ekspresyonu analizleri ve biyokimyasal veya fonksiyonel analizler nörodejeneratif hastalıklar bağlamında iyi tanımlanmış hücre alt tipleri, üzerine farmakolojik tedavi veya gen tedavisi bağlamında değişen, nörobilimcinin elinde araçların repertuarını genişletebilecek çeşitli uygulamaların önünü açar.

Fare beynine ve omuriliğe uygulanan iki farklı homojenizasyon yöntemini (DH karşı PD) karşılaştırdık ve downstream uygulamalarına uygun farklı canlı hücre tiplerinin alınmasında verimliliği test ettik. Bunu yapmak için, aynı örnekte, mikroglia, lenfositler, nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve endotel dahil olmak üzere farklı CNS hücre tiplerini karakterize etmek için tasarlanmış 9 renkli akış sitometri panelinden yararlandık.
Beyin ve omurilik dokuları fa...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods at JoVE.c

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.

Farklı Homojenizasyon Yöntemleri ile Fare Beyin/Omurilikten Alınan Çoklu Hücre Tiplerinin Eşzamanlı Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Nörodejeneratif bozuklukları tedavi etmek için seçici gen ve ilaç dağıtım araçlarının geliştirilmesi, yeniden yönetim üzerine, hücre hedefleme nicelleştirme ve karakterizasyon gerektirir, veya viral vektörler, ya da nano tanecikleri. Onlar akış sitometri üretim ve multiplexing yetenekleri var, fare beyin ve omurilik birden fazla hücre türlerinin basit ve eşzamanlı kimlik sağlar. Prosedürü gösteren Francisco Javier Molina Estevez, Alexander's Laboratory bir post-doc olacaktır.Sekiz haftalık C57 Black 6 fareden beyin ve omurilik hasat sonra, buz üzerinde iyi başına buz soğuk HPSS iki mililitre içeren, altı iyi plaka bireysel kuyular içine dokuları yerleştirin. Her hasat edilen dokuyu iki eşit parçaya bölün. Ve bir ila iki milimetre kalınlığında parçalar halinde her doku örneğinin bir yarısını kıyma makas kullanın.Tüm dokular parçalandığında, HPSS'de değiştirilmiş 1.000 mikrolitrelik pipet ucunu önceden durulayın ve her doku süspansiyonunun tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarılması için pipetkullanın. Kuyuları her kuyuda iki mililitre HPSS ile durula. Ve ilgili 15 mililitrelik konik tüpler de yıkın.Numuneleri santrifüj ile tortulat. Ve bir nöral doku dissosyasyon kitinden 50 mikrolitre Enzim P'yi numune başına kitten 1,900 mikrolitre Tampon X ile karıştırın. Enzim karışımını en az 10 dakika boyunca 37 derecede ısıtın.Ve her doku toplama tüpünden süpernatant aspire. Enzim karışımı hazır olduğunda, her numuneye çözeltinin 1,95 mililitresini ekleyin. Ve peletleri yeniden askıya almak için yavaşça girdap.Daha sonra, numuneleri bir tekerlek üzerinde 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 10 mikrolitre A Enzimini numune başına 20 mikrolitre Tampon Y ile karıştırın. Sallayarak kuluçka sonunda her doku çözeltisi için çözelti 30 mikrolitre eklemeden önce, 37 santigrat derece ikinci enzim çözeltisi önceden ısıtın. Her numuneyi hafifçe karıştırmak için HPSS ile önceden durulanmış 1.000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.Ve numuneleri 37 derecede 15 dakika boyunca tekerleğe geri götürün. Kuluçka sonunda, buz gibi HPSS 10 mililitre ile enzimatik reaksiyonlar tutuklamak. Ve numuneleri santrifüj le tortula.Santrifüjün sonunda, tüp başına yedi mililitre buz gibi HPSS peletleri yeniden askıya alın. Ve tüpleri buzda tutmadan önce her numuneyi yavaşça girdaplayın. Doku homojenizasyonu için, bir dounce doku öğütücü önceden soğutulmuş cam harç için önceden soğutulmuş HPSS üç mililitre ekleyin ve toplanmış beyin veya omurilik dokusu örneklerinden birinin ikinci yarısını harç aktarın.Yavaşça Pestle A 10 vuruş ile doku macerate, Pestle B.10 vuruş takip ve yeni bir 15 mililitre konik tüp içine homojenize karışımı transfer. Tüpü, santrifüj için önceden soğutulmuş HPSS ile 10 mililitrelik son bir hacimle doldurun. Ve numuneyi buzda tutmadan önce, yedi mililitre taze HPSS'de girdap ile peleti yeniden askıya alın.Enkaz kaldırma için, her sindirilmiş veya homojenize örnek için önceden soğutulmuş İzotonik Percoll çözeltisi üç mililitre ekleyin. Ve homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olmak için numuneleri yavaşça girdaplayın. Daha sonra, numuneleri santrifüj edin ve çözeltinin yüzeyinde yüzen enkaz ve miyelinin beyazımsı diskini dikkatlice çıkarın.Enkaz atıldığında, peletrahatsız olmadan her tüpten supernatant son 100 mikrolitre hariç tüm toplamak. Tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarmak için bir mililitre FACS BL çözeltisi içinde her peleti yeniden askıya alın. Percoll çözeltisi ile bu entegrasyondan sonra, numune kaybını önlemek için hücre peletini çıkarmadan enkaz diskini ve süpernatantı çok dikkatli bir şekilde çıkarmak önemlidir.Santrifüjden sonra, her tüpten süpernatantı dikkatlice aspire edin ve tüp başına 350 mikrolitre taze FACS BL peletleri yeniden askıya alın. İzole hücre tiplerinin akış sitometrik analizi için, tabloda belirtilen protokole göre her tüpe uygun antikor eklemeden önce numuneleri tüp başına mililitre başına beş mikrogram fc bloğu ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Girdap her tüp karışımı için beş saniye.Ve örnekleri ışıktan korunan 15 dakika boyunca 4 derece yedirin. Kuluçka sonunda, tüp başına pbs bir mililitre ile örnekleri yıkayın, ve santrifüj. Tüp başına streptavidin uygun hacimde peletyeniden askıya.Karıştırmak için girdap sonra, ışıktan korunan dört derece santigrat 10 dakika boyunca örnekleri kuluçka. Ve gösterildiği gibi tüp başına pbs bir mililitre ile hücreleri yıkayın. Supernatants attıktan sonra, tüp başına taze FACS BL 300 mikrolitre pelet yeniden askıya.Ve her numuneyi 5 mikrolitre 7-AAD ile etiketle. Daha sonra numuneleri ışıktan korunan dört santigrat derecede sitoflorometrik analize kadar saklayın. Homojenizasyon yöntemi genel olarak hem beyin hem de omurilikten daha yüksek bir hücre verimi üretir, ancak alınan hücrelerin çoğu tipik olarak ölüdür, bu da sadece ve beyinden canlı hücrelerin yaklaşık %14'ünün iyileşmesi ve yaklaşık %10'unun omurilikten iyileşmesi ile sonuçlanır.Buna karşılık, papain sindirim yöntemi hücresel canlılık genel olarak daha iyi korunması ile sonuçlanır. Dokuz renkli bi-akış sitometri ile beyin ve omurilik hücresi süspansiyonlarının analizi, CD45+CD11b+microglia ve makrofajların varlığını ortaya koymaktadır. Ve her iki dokuda CD45+CD11b-lenfositler.CD45 hücreli popülasyonlar daha sonra astrosit, ya da oligodendrosit belirteçleri, ya da feriyonal ve endotel yüzey belirteç ifade için kendi pozitifliğine göre ayırt edilebilir. Homojenizasyon yöntemi kullanılarak canlı hücrelerin %32 ila %38'i hematopoetik kökenlidir. Enzimatik sindirim yöntemi hematopoetik olmayan CD45 hücrelerinin çok büyük bir kısmının alınmasıyla sonuçlanırken.Dikkat çekici bir şekilde, CD45+CD11b+mikroglia ve makrofajlar homojenizasyon yöntemi ile en bol canlı hücre fraksiyonunu temsil eder. Sindirim yöntemi, ancak, astrositler de dahil olmak üzere hücre tiplerinin daha heterojen bir temsil üretir, oligodendrositler, endotel hücreleri, ve nöronlar. Bu protokol çok yönlüdür ve belirli hücre alt popülasyonlarının niceleifikasyonu veya izolasyonu, birincil kültür veya biyokimyasal veya RNA sıralama analizi gibi çeşitli alt akım uygulamaları için kullanılabilir.Bu ilerleme sırasında veya endotrofik lateral sklerozun fare modelinde tedavi sonrası farklı CNS popülasyonlarının gen ekspresyonunu ve fonksiyonel imzalarını değerlendirmek için bu protokolü uyguladık.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Sıçanlarda Spinal Kord Yaralanma sonrası Akut ve Kronik Dokunsal Duyu Testi

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

A Radyo-telemetrik Sistemi Omurilik transeksiyonu ve Embriyonik Nöral Hücre Greftler Kök Sıçanlarda Kardiyovasküler Fonksiyonu Monitör

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Deneysel Spinal Kord Yaralanmalarında Omurilik Kan Akımının Değerlendirilmesi için geliştirilmiş Ultrason Görüntüleme Kontrast

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Fare Serebral Hipoksi-iskemi sırasında Eşzamanlı PET / MR Görüntüleme

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...