Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

وأجريت اعمال التصوير في مركز جامعه نورث وسترن لمجهر المتقدمة بسخاء بدعم من الكلية CCSG P30 CA060553 منحت لمركز روبرت H لوري الشامل للسرطان. نشكر شون ماكدرمت لمساعدته الفنية ودعمه ، ومايا ابستاين للرسوم التوضيحية المرسومة باليد المبينة في الشكل 1.

وأجريت جميع التجارب المتعلقة بالماشية وفقا للجنة الدراسات الحيوانية بجامعه نورث وسترن.
1. الاعداد قبل الثقافات شريحة المخيخ الشكل العضوي
<ol><li>في خليه الثقافة هود رش مع 70 ٪ الايثانول مسبقا ، واعداد 200 mL من الوسط الثقافي في فلتر فراغ زجاجه 250 mL تعلق علي جهاز استقبال زجاجه معقم?...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

الثقافة شريحة المخيخ هو أداه قويه لدراسة الموت المبرمجة الخلية Purkinje اثناء التنمية بعد الولادة. يمكن استخدام هذه التقنية لفحص الجزيئات المرشحة بسرعة لإمكاناتها المحصنة. الميزة الرئيسية هي ان الاعداد بسيط وفعال من حيث التكلفة جدا ، ويتطلب فقط استثمار متواضع في المعدات (يمكن ان تكلف الذبذب?...

النمذجة في المختبر هو أداه أساسيه في البحوث الطبية الحيوية. وهو يسمح للمحققين بدراسة ومراقبه أليات محدده في أنواع الخلايا المقيدة ، أو في النظم/الاجهزه المعزولة. ثقافة شريحة التنميط العضوي هي تقنيه تستخدم علي نطاق واسع في المختبر ، وخاصه في مجال علوم الأعصاب1. تاسست هذه الطريقة لأول مره من قبل Gähwiler ، الذي مثقف شرائح الدماغ باستخدام تقنيه أنبوب الاسطوانه2، وتعديلها في وقت لاحق من قبل ياماموتو وآخرون ، الذي ادخل استخدام غشاء ميكرومساميه لأداء الثقافات شريحة القشرية3. بالمقارنة مع ثقافات الخلايا الاوليه ، تقدم ثقافات الشريحة العضوية ميزه الحفاظ علي البنية الخلوية للانسجه ، فضلا عن اتصالات خلايا الخلايا الاصليه في الجزء الخاص بالانسجه.
وقد تم استزراع شرائح التنميط العضوي من أجزاء كثيره من الجهاز العصبي المركزي ، مثل الحصين4، اللحاء5، سترياتوم6، المخيخ4،7، والحبل الشوكي8،9، من بين أمور أخرى. وقد ثبت انها أداه قويه في دراسات اكتشاف المخدرات10. يمكن تقييم اثار الجزيئات العصبية بطرق عديده: البقاء علي قيد الحياة والضمور العصبي باستخدام اختبارات المناعة والكيمياء الحيوية ، وتشكيل دوائر الخلايا العصبية ، أو التعطيل باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير الحي.
والهدف من هذا العمل هو وصف طريقه بسيطه لأداء ثقافة شريحة المخيخ المجسمة ، والتي من المعروف انها نموذج مناسب لتقليد التطور المخيخ في المختبر. وعلي وجه الخصوص ، ركزنا علي دراسة وفاه الخلية Purkinje النمو. في الجسم المجري, خلايا Purkinje الخضوع للخلايا المبرمج خلال الأسبوع الأول بعد الولادة, ذروتها في اليوم بعد الولادة 3 (P3)11. لوحظ نفس النمط في الثقافة شريحة المخيخ ، مع الخلايا العصبية purkinje الموت من قبل المبرمج عندما تؤخذ المخيخ من الحيوانية بين P1 و P8 ، مع ذروه في P34،12. وقد سمح استخدام الثقافات شريحة المخيخ الشكل العضوي لتحديد عده جزيئات نيوروبروتكتيف7,13, فضلا عن فهم جزء من أليات المعنية في هذه الخلية المبرمجة الموت14,15,16. هنا ، ونحن وصف بروتوكول يستند إلى دراسة ستوبيني وآخرون17 في الحصين ، وتكييفها مع المخيخ من قبل dusart وآخرون4 ويشمل تشريح السريع وتقطيع المخيخ بعد الولادة. تشريح الثقافة علي الخلية الثقافة ادراج تحتوي علي غشاء ميكرومساميه ، مع أو بدون علاج نيوروبروتكتيف ؛ وتلطيخ المناعي لتقييم بقاء الخلايا العصبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

ثقافة شريحة التنميط العضوي هو نموذج قوي في المختبر الذي يقلد في ظروف الجسم الآخر عن كثب من الثقافات الخلية الاوليه المنفصلة. في مرحله ما بعد الولادة المبكرة ، من المعروف ان خلايا المخيخ Purkinje تمر خلال فتره الضعف ، والتي تمر خلالها بموت الخلايا المبرمج. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لأداء الماوس الظاهرية شريحة المخيخ الثقافة خلال هذا الوقت الحرج. وتصنف الشرائح كذلك لتقييم بقاء الخلية Purkinje وفعالية العلاجات نيوروبروتكتيف. هذه الطريقة يمكن ان تكون قيمه للغاية للشاشة لجزيئات نيواكتيف جديده.

وكما هو مبين في الشكل 4، ينتج هذا البروتوكول الثقافات المجسمة لشريحة المخيخ التي يمكن تقييم بقاء خليه Purkinje فيها بعد الخطوات المناعية والحصول علي الصورة. تم تسميه الخلايا purkinje مع مزيج من المضادة-Calbindin د-28K (تخفيف 1/200) و Alexa594 مكافحه الماوس (تخفيف 1/300) الأجسام المضادة. وقد تم خياط...

Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

الثقافات شريحة التنميط العضوي هي أداه قويه لدراسة العمليات العصبية أو التنكسية/التجدد. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي نماذج وفاه النمو العصبي للخلايا Purkinje في الثقافات شريحة الفئران المخيخ. هذا الأسلوب قد تستفيد البحوث في اكتشاف المخدرات نيوروبروتكتيف.

البقاء علي قيد الحياة خليه purkinje في الثقافات شريحة المخيخ الوراثية

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

تعتبر ثقافة شريحة Organotypic أداة قوية لدراسة العمليات العصبية النمائية والتنكسية أو التجديدية. ويمكن استخدام هذه التقنية لفرز بسرعة الجزيئات المرشحة لإمكاناتها العصبية. هذه الطريقة تحاكي عن كثب في ظروف الجسم الحي ، مقارنة بثقافات الخلايا الأولية المنفصلة ، حيث يتم الحفاظ على بنية مجموعة الأنسجة واتصالات الخلايا الخلوية الأصلية داخل مستويات الأقسام.هنا نبرهن على دراسة موت خلايا بوركينجي في المخيخ النامي. ولكن ثقافة شريحة الأعضاء هي مناسبة على قدم المساواة لنموذج الأمراض العصبية في كل منطقة الجهاز العصبي المركزي تقريبا. إثبات الإجراء مع جنيفر Rakotomamonjy سيكون شون ماكديرموت، وهو فني من مختبري.قبل حصاد شرائح cerebellar، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية معقمة، ملء كل بئر من لوحة ثقافة ستة بئر مع ملليلتر واحد من فراغ تصفية الثقافة المتوسطة، وإضافة عامل الدوائية ذات الفائدة لآبار العلاج، وحجم متساو من السيارة إلى آبار التحكم. باستخدام ملقط معقمة، وضع واحد 0.4 ميكرومتر المسام حجم PTFE غشاء مرشح إدراج في كل بئر، مع الحرص على تجنب فقاعات في واجهة كل غشاء والمتوسطة، وتكليل المتوسطة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ساعتين. لحصاد المخيخ، استخدم ملقط خلع الملابس مباشرة لفهم رأس الجرو من الأنف، واستخدام مقص العين مباشرة لقطع فتح فروة الرأس من النهاية الخلفية في الجانب الآخر إلى خط الوسط.قطع فتح الجمجمة بنفس الطريقة، مشيرا إلى نصائح مقص إلى الخارج لتجنب إتلاف المخيخ، واستخدام ملعقة لنقل الدماغ إلى طبق 60 ملليمتر تحتوي على HBSS الباردة وخمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الجلوكوز. استخدام ملقط خلع الملابس على التوالي لتشريح بعناية خارج المخيخ، واستخدام ملقط ناعم منحني معقمة لوضع الأنسجة على قرص بلاستيكي على طاولة القطع من المروحية الأنسجة. تدوير الجدول القطع لتوجيه الأنسجة للسماح لاقتناء المقاطع parasagittal، وسحب مقبض الطاولة الإفراج إلى اليمين لنقل الجدول القطع حتى يتم وضع شفرة على حافة الأنسجة.ثم ضبط سمك شريحة إلى 350 ميكرومتر، وسرعة شفرة إلى متوسطة، وبدء المروحية. عندما يتم تقطيع المخيخ بأكمله، قم بإيقاف تشغيل المروحية. باستخدام ملقط معقمة، عقد القرص على طبق جديد 60 ملليمتر.استخدام ماصة نقل لطرد HBSS بالإضافة إلى الجلوكوز على القرص بحيث تقع شرائح في الطبق. ثم، لمس العينات بأقل قدر ممكن، استخدم microprobe لفصل الشرائح. استخدام ماصة نقل لتحديد أجزاء من المخيخ على مقربة من vermis على إدراج ثقافة الخلية الفردية في لوحة ستة جيدا، واستخدام microprobe لوضع شرائح في مركز كل إدراج.عندما تم وضع جميع الشرائح، وpireate بعناية أي HBSS الزائدة بالإضافة إلى الجلوكوز، والعودة لوحة إلى الحاضنة ثقافة الخلية. لطخة الفلوروس المناعية، وإزالة افرنح من كل بئر، وغسل إدراج مع برنامج تلفزيوني. إصلاح شرائح مع ملليلتر واحد من 4٪ paraformaldehyde الباردة في بئر كل إدراج، و 500 ميكرولترات على رأس كل إدراج لمدة ساعة واحدة.في نهاية التثبيت، وغسل إدراج أربع مرات لمدة 10 دقائق مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد تحت كل إدراج و 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد على رأس كل إدراج لكل غسل على شاكر المدارية. قبل ملء كل بئر من لوحة 24-well مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني TB، واستخدام فرشاة الطلاء لنقل شرائح cerebellar من كل ثقافة الخلية إدراج في الآبار الفردية من لوحة 24 جيدا. Permeabilize وحجب شرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.في نهاية الحضانة، وتسمية الخلايا مع 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة المخففة في برنامج تلفزيوني - السل في البئر بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر المدارية. في صباح اليوم التالي، وغسل شرائح أربع مرات لمدة 10 دقائق و 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل على شاكر، قبل وضع علامة على العينات مع الأجسام المضادة الثانوية الفلوروومي المناسبة مترافق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، و counterstain أقسام مع 500 microliters من وصمة عار النووية المناسبة في بئر لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.واستخدم ماصة نقل لتركيب الشرائح على الشرائح الزجاجية. ثم اسمحوا الهواء أقسام جافة تماما قبل إعادة الجفاف مع برنامج تلفزيوني وتركيب الأنسجة مع أغطية مغلفة مع ما يقرب من 80 ميكرولترات من المتوسط المتصاعدة. بمجرد أن يتم شفاء المتوسطة المتصاعدة ، تصبح أقسام cerebellar جاهزة للصور.في اليوم التالي للولادة ستة، بقاء خلية بوركيني منخفض في عينات التحكم، بما يتفق مع نافذة الضعف المعروفة. يزداد البقاء على قيد الحياة مع تقدم الحيوان المانح في السن وخروجه من هذه الفترة الحرجة. علاج شرائح cerebellar مع تركيز عال من كلوريد البوتاسيوم النتائج في الحث الناجح من إزالة القطب والبقاء على قيد الحياة.للحصول على نتائج متناسقة وقابلة لإعادة إنتاجها، من الضروري تحديد أقسام سيريبيلار صحية، وإجراء إعداد الثقافة بأكبر قدر ممكن من الكفاءة. تتجاوز تطبيقات ما بعد الاستزراع الفلورات المناعية. كما يمكن استخدام شرائح organotypic لدراسات التعبير عن بروتين الجينوم، ورصد نشاط الدوائر العصبية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية والكالسيوم التصوير الحي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

بعد تضمين التعريف Immunogold من البروتينات متشابك في الثقافات شريحة الحصين

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...