Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Imaging arbejde blev udført på Northwestern University Center for Advanced Microscopy generøst støttet af NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for hans tekniske assistance og støtte, og Maya Epstein for de håndtegnede illustrationer, der er vist i figur 1.

Alle forsøg, der involverer dyr, blev udført i overensstemmelse med det nordvestlige Universitet dyreforsøg udvalg.
1. forberedelse forud for organotypiske cerebellare skive kulturer
<ol><li>I en cellekultur hætte sprøjtet med 70% ethanol på forhånd, forberede 200 mL af kulturmedium i en 250 mL flaske-Top vakuum filter fastgjort til en steril flaske modtager. Tilsæt 100 mL basal medium Eagle (BME), 50 mL Hanks afbalanceret salt opløsning (HBSS), 50 mL varme inaktiveret heste serum, ...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

Cerebellar skive kultur er et kraftfuldt værktøj til at studere programmeret Purkinje celledød under postnatal udvikling. Denne teknik kan bruges til hurtigt at screene kandidat molekyler for deres neuroprotektive potentiale. Den største fordel er, at opsætningen er enkel og meget omkostningseffektiv, og kræver kun en beskeden investering i udstyr (en vibratome kan koste op til 3 gange mere end en vævs chopper). Desuden kan 10 til 15 sunde skiver genereres fra en mus pup, giver mulighed for forskellige analyser, d...

In vitro modellering er et vigtigt redskab i biomedicinsk forskning. Det giver forskerne mulighed for at studere og stramt kontrollere specifikke mekanismer i begrænset celletyper, eller i isolerede systemer/organer. Organotypiske skive kultur er en meget anvendt in vitro-teknik, især inden for neurovidenskab1. Metoden blev først etableret af Gähwiler, der dyrkede hjerne skiver ved hjælp af valse røret Technique2, og senere modificeret af Yamamoto et al., der introducerede brugen af en Mikroporøs membran til at udføre kortikale skive kulturer3. Sammenlignet med primære cellekulturer, organotypiske skive kulturer præsentere fordelen ved at bevare den cytoarkitektur af vævet, samt indfødte celle-celleforbindelser i flyet af vævs sektionen.
Organotypiske skiver er blevet dyrket fra mange dele af det centrale nervesystem, såsom hippocampus4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7, og rygmarven8,9, blandt andre. De har vist sig at være et kraftfuldt værktøj i Drug Discovery undersøgelser10. Virkningerne af Neuro aktive molekyler kan vurderes på mange måder: overlevelse og neurodegeneration ved hjælp af immun farvning og biokemiske analyser, neuronal kredsløb dannelse, eller afbrydelse ved hjælp af Elektrofysiologi og Live-imaging.
Målet med dette arbejde er at beskrive en simpel metode til at udføre organotypiske cerebellar skive kultur, som er kendt for at være en relevant model til at efterligne cerebellare udvikling in vitro. Især fokuserede vi på studiet af Purkinje Cell udviklingsmæssige død. In vivo gennemgår Purkinje celler apoptose i løbet af den første postnatale uge og toppede på postnatale dag 3 (P3)11. Det samme mønster er observeret i cerebellare skive kultur, med Purkinje neuroner dør af apoptose, når cerebella er taget fra dyr mellem P1 og P8, med et højdepunkt på P34,12. Brugen af den organotypiske cerebellare skive kulturer har gjort det muligt at identificere flere neuroprotektive molekyler7,13, samt forståelse en del af de mekanismer, der er involveret i denne programmerede celledød14,15,16. Her beskriver vi en protokol baseret på studiet af Stoppini et al.17 i hippocampus og tilpasset cerebellum af Dusart et al.4 det omfatter hurtig dissektion og hakning af postnatal cerebella; udskæring af kulturen på en cellekultur indsats, der indeholder en Mikroporøs membran, med eller uden neuroprotektive behandling; og immunofluorescens farvning for at vurdere neuronal overlevelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

Organotypiske skive kultur er en kraftfuld in vitro-model, der efterligner in vivo betingelser tættere end dissocierede primære cellekulturer. I den tidlige postnatal udvikling, cerebellar Purkinje celler er kendt for at gå gennem en sårbar periode, hvor de gennemgår programmeret celledød. Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre mus organotypic cerebellar skive kultur i denne kritiske tid. Udsnittene er yderligere mærket for at vurdere Purkinje-cellens overlevelse og effekten af neuroprotektive behandlinger. Denne metode kan være yderst værdifuld at screene for nye Neuro aktive molekyler.

Som vist i figur 4producerer denne protokol organotypiske cerebellare skive kulturer, hvor Purkinjes celle overlevelse kan vurderes efter immunofluorescens-og billed erhvervelses trinene. Purkinje celler blev mærket med en kombination af anti-Calbindin D-28K (fortynding 1/200) og Alexa594 anti-mus (fortynding 1/300) antistoffer. Billede syning blev gjort automatisk af mikroskop erhvervelse software (NIS-elementer) for at få et billede af hele cerebellar skive. Purkinje-celle numrene pr. sk...

Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypiske skive kulturer er et kraftfuldt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige eller degenerative/regenerative processer. Her beskriver vi en protokol, der modeller den neuroudviklingsmæssige død af Purkinje celler i mus cerebellar skive kulturer. Denne metode kan gavne forskning i neuroprotektive Drug Discovery.

Purkinje-cellernes overlevelse i Udsnitskulturer af Organotypiske cerebellar

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotypisk skivekultur er et effektivt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige og degenerative eller regenerative processer. Denne teknik kan bruges til hurtigt at screene kandidat molekyler for deres neuroprotektive potentiale. Denne metode nøje efterligner i vivo betingelser, sammenlignet med dissocierede primære cellekulturer, som væv sæt arkitektur og indfødte celle-celle forbindelser bevares i de planer af sektionerne.Her viser vi studiet af Purkinje celledød i den udviklende lillehjernen. Men organotypisk skive kultur er lige så velegnet til model neurodegenerative sygdomme i næsten alle centralnervesystemet region. Demonstrere proceduren med Jennifer Rakotomamonjy vil være Sean McDermott, en tekniker fra mit laboratorium.Før høst cerebellar skiver, i en steriliseret biosikkerhed kabinet, fylde hver brønd af en seks-brønd kultur plade med en milliliter vakuum-filtreret kultur medium, og tilsæt farmakologisk agent af interesse for behandling brønde, og en lige mængde køretøj til kontrol brønde. Brug sterile kraftvipper, placere en 0,4-mikrometer pore størrelse PTFE membran filter indsætte i hver brønd, idet du skal passe på at undgå bobler på grænsefladen af hver membran og mediet, og ækvibrer medium i en 37 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator i to timer. At høste lillehjernen, bruge lige dressing kraftvipper til at gribe hvalpen hovedet ved næsen, og bruge lige øje saks til at skære åbne hovedbunden fra den bageste ende sideom side til midterlinjen.Skær kraniet op på samme måde og peg saksspidserne udad for at undgå at beskadige lillehjernen, og brug en spatel til at overføre hjernen til en 60-millimeter skål indeholdende kold HBSS og fem milligram pr. milliliter glukose. Brug lige dressing kraftang til omhyggeligt dissekere ud lillehjernen, og bruge sterile buede fine kraftang til at placere vævet på en plastik skive på skærebordet af en væv chopper. Drej skærebordet for at orientere vævet, så der kan anskaffes parasagittalsektioner, og træk bordudløserknappen til højre for at flytte skærebordet, indtil klingen er placeret ved kanten af vævet.Juster derefter skivetykkelsen til 350 mikrometer, og klingens hastighed til medium, og start hakkeren. Når hele lillehjernen er skåret, skal du slukke for helikopteren. Brug sterile kraftbecer, hold disken over en ny 60-millimeter skål.Brug en overførselspipette til at skylle HBSS plus glukose over disken, så skiverne falder ned i skålen. Derefter rører prøverne så minimalt som muligt, skal du bruge en mikrosonde til at adskille skiverne. Brug overførselspipetten til at vælge dele af lillehjernen tæt på vermis på individuelle cellekulturindsatser i seks-brøndpladen, og brug mikrosonden til at placere skiverne i midten af hvert skær.Når alle skiverne er placeret, aspirere forsigtigt overskydende HBSS plus glukose, og returnere pladen til cellekultur inkubatoren. For immunfluorescensfarvning fjernes supernatanten fra hver brønd, og skærne vaskes med PBS. Fastgør skiverne med en milliliter kold 4% paraformaldehyd i brønden af hver indsats, og 500 mikroliter oven på hver indsats i en time.Ved afslutningen af fikseringen vaskes skærene fire gange i 10 minutter med en milliliter frisk PBS under hvert skær og 500 mikroliter frisk PBS oven på hver indsats pr. vask på en orbitalshaker. Forfyld hver brønd af en 24-brønd plade med 500 mikroliter PBS-TB, og brug en pensel til at overføre cerebellar skiver fra hver cellekultur indsætte i individuelle brønde af en 24-brønd plade. Permeabilize og blokere skiver ved stuetemperatur i en time.Ved inkubationens afslutning mærkes cellerne med 200 mikroliter af det primære interesseantistof, der fortyndes i PBS-TB pr. brønd natten over ved fire grader Celsius på orbitalshaskeren. Næste morgen vaskes skiverne fire gange i 10 minutter og 500 mikroliter frisk PBS pr. vask på shakeren, før prøverne mærkes med de relevante fluorophorekonjugered sekundære antistoffer i to timer ved stuetemperatur på rysteren, beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning modvirkes sektionerne med 500 mikroliter af en passende nuklear plet pr. brønd i 10 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.Og brug en overførselspipette til at montere skiverne på glasdias. Lad derefter sektionerne lufttørre helt, før de rehydreres med PBS og montere væv med dækslæber belagt med ca. 80 mikroliter monteringsmedium. Når monteringsmediet er hærdet, er cerebellar-sektionerne klar til at blive afbildet.På postnatal dag seks, Purkinje celle overlevelse er lav i kontrol prøver, i overensstemmelse med deres kendte sårbarhed vindue. Overlevelse stiger som donordyret bliver ældre og forlader denne kritiske periode. Behandlingen af cerebellar skiver med en høj koncentration af kaliumchlorid resulterer i en vellykket induktion af deres depolarisering og overlevelse.For at opnå ensartede og reproducerbare resultater er det afgørende at vælge sunde cerebellarsektioner og at udføre kulturopsætningen så effektivt som muligt. Post-kultur applikationer går ud over immunfluorescens. Som organotypiske skiver kan bruges til genom protein ekspression undersøgelser, og til overvågning neuronal kredsløb aktivitet ved hjælp af elektrofysiologi og calcium levende billeddannelse.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-embedding immunogold mærkning af synaptiske proteiner i hippokampalskivekulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypiske skivekulturer at studere oligodendrocyt Dynamics og myelinering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Selektiv Udtømning af Mikroglia fra cerebellare Granule cellekulturer anvendelse af L-leucin-methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...