Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Die Bildarbeiten wurden am Northwestern University Center for Advanced Microscopy durchgeführt, die von NCI CCSG P30 CA060553 großzügig an das Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center verliehen wurde. Wir danken Sean McDermott für seine technische Unterstützung und Unterstützung und Maya Epstein für die handgezeichneten Illustrationen in Abbildung 1.

Alle Versuche mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem Northwestern University Animal Studies Committee durchgeführt.
1. Zubereitung vor organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen
<ol><li>In einer Zellkulturhaube, die vorher mit 70% Ethanol besprüht wurde, 200 ml Kulturmedium in einem 250 ml Flaschen-Top-Vakuumfilter vorbereiten, der an einem sterilen Flaschenempfänger befestigt ist. Fügen Sie 100 ml Basal Medium Eagle (BME), 50 ml Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 ml hitzeina...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

Cerebellar Slice Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um programmiertpuren Zelltod während der postnatalen Entwicklung zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle schnell auf ihr neuroprotektives Potenzial zu untersuchen. Der Hauptvorteil ist, dass die Einrichtung einfach und sehr kostengünstig ist und nur eine bescheidene Investition in die Ausrüstung erfordert (ein Vibratome kann bis zu 3-mal mehr kosten als ein Gewebe-Chopper). Darüber hinaus können 10 bis 15 gesunde Scheiben a...

In-vitro-Modellierung ist ein wesentliches Werkzeug in der biomedizinischen Forschung. Es ermöglicht den Forschern, spezifische Mechanismen in eingeschränkten Zelltypen oder in isolierten Systemen/Organen zu untersuchen und streng zu kontrollieren. Organotypische Scheibenkultur ist eine weit verbreitete In-vitro-Technik, vor allem im Bereich der Neurowissenschaften1. Die Methode wurde zuerst von Gähwiler etabliert, der Gehirnscheiben mit der Rollenrohrtechnik2kultivierte, und später modifiziert von Yamamoto et al., der die Verwendung einer mikroporösen Membran einführte, um kortikale Scheibenkulturen durchzuführen3. Im Vergleich zu primären Zellkulturen bieten organotypische Scheibenkulturen den Vorteil, die Zytoarchitektur des Gewebes sowie einheimische Zell-Zell-Verbindungen in der Ebene des Gewebeabschnitts zu erhalten.
Organotypische Scheiben wurden aus vielen Teilen des zentralen Nervensystems kultiviert, wie der Hippocampus4, Cortex5, Striatum6, Kleinhirn4,7, und Rückenmark8,9, unter anderem. Sie haben sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in Drogen-Entdeckungsstudien10. Die Auswirkungen neuroaktiver Moleküle können auf vielfältige Weise bewertet werden: Überleben und Neurodegeneration mit Immunostaining- und Biochemie-Assays, neuronale Schaltungsbildung oder Unterbrechung enthoben mit Elektrophysiologie und Live-Imaging.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine einfache Methode zu beschreiben, um organotypische Kleinhirn-Scheibenkultur durchzuführen, die bekanntermaßen ein relevantes Modell ist, um die Entwicklung von Kleinhirn in vitro nachzuahmen. Insbesondere konzentrierten wir uns auf die Untersuchung des Purkinje-Zellentwicklungstodes. In vivo, Purkinje-Zellen unterziehen Apoptose während der ersten postnatalen Woche, Höhepunkt am postnatalen Tag 3 (P3)11. Das gleiche Muster wird in der Kleinhirnscheibenkultur beobachtet, wobei Purkinje-Neuronen durch Apoptose sterben, wenn Kleinhirn von Tieren zwischen P1 und P8 genommen wird, mit einem Spitzenwert bei P34,12. Die Verwendung der organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen hat es ermöglicht, mehrere neuroprotektive Moleküle7,13, sowie das Verständnis eines Teils der Mechanismen, die an diesem programmierten Zelltod beteiligt sind, zu identifizieren14,15,16. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Untersuchung von Stoppini et al.17 im Hippocampus basiert und von Dusart et al. an Kleinhirn angepasst wurde.4 Es beinhaltet eine schnelle Zerlegung und Zerkleinerung der postnatalen Kleinhirn; Kultur auf einen Zellkultureinsatz schneiden, der eine mikroporöse Membran mit oder ohne neuroprotektive Behandlung enthält; und Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung des neuronalen Überlebens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

Organotypische Scheibenkultur ist ein leistungsfähiges In-vitro-Modell, das in vivo Bedingungen näher imitiert als dissoziierte primäre Zellkulturen. In der frühen postnatalen Entwicklung, Kleinhirn Purkinje Zellen sind dafür bekannt, durch eine anfällige Periode zu gehen, in der sie programmierten Zelltod. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um in dieser kritischen Zeit eine organotypische Kleinhirn-Slice-Kultur der Maus durchzuführen. Die Scheiben werden weiter gekennzeichnet, um das Überleben der Purkinje-Zellunde und die Wirksamkeit neuroprotektive Behandlungen zu bewerten. Diese Methode kann extrem wertvoll sein, um auf neue neuroaktive Moleküle zu überprüfen.

Wie in Abbildung 4dargestellt, produziert dieses Protokoll organotypische Kleinhirnscheibenkulturen, in denen das Überleben von Purkinje-Zellen nach den Immunfluoreszenz- und Bildaufnahmeschritten beurteilt werden kann. Purkinje-Zellen wurden mit einer Kombination von Anti-Calbindin D-28K (Verdünnung 1/200) und Alexa594 Anti-Maus-Antikörper (Verdünnung 1/300) Anti-Maus-Antikörper gekennzeichnet. Die Bildnähte wurden automatisch von der Mikroskoperfassungssoftware (NIS-Elemente) durchge...

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Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotypische Scheibenkultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde und degenerative oder regenerative Prozesse zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle schnell auf ihr neuroprotektives Potenzial zu untersuchen. Diese Methode imitiert in vivo-Bedingungen im Vergleich zu dissoziierten primären Zellkulturen eng, da die Gewebesatzarchitektur und die nativen Zell-Zell-Verbindungen innerhalb der Ebenen der Abschnitte erhalten bleiben.Hier zeigen wir die Untersuchung des Purkinje-Zelltodes im sich entwickelnden Kleinhirn. Aber die organotypische Scheibenkultur eignet sich gleichermaßen, um neurodegenerative Erkrankungen in fast jeder Region des zentralen Nervensystems zu modellieren. Das Verfahren mit Jennifer Rakotomamonjy demonstriert Sean McDermott, ein Techniker aus meinem Labor.Vor der Ernte der Kleinhirnscheiben, in einem sterilisierten Biosicherheitsschrank, füllen Sie jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte mit einem Milliliter vakuumgefilterten Kulturmedium, und fügen Sie das pharmakologische Mittel von Interesse zu den Behandlungsbrunnen, und ein gleiches Volumen des Fahrzeugs zu den Kontrollbrunnen. Mit sterilen Zangen, legen Sie eine 0,4-Mikrometer Porengröße PTFE Membranfilter-Einsatz in jedem Brunnen, wobei darauf geachtet wird, Blasen an der Schnittstelle jeder Membran und des Mediums zu vermeiden, und das Medium in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator für zwei Stunden ausdemieren. Um das Kleinhirn zu ernten, verwenden Sie gerade Dressing Zangen, um den Welpenkopf an der Nase zu greifen, und verwenden Sie gerade Augenschere, um die Kopfhaut vom hinteren Ende seitlich bis zur Mittellinie zu schneiden.Schneiden Sie den Schädel auf die gleiche Weise, zeigen Sie die Scherenspitzen nach außen, um eine Beschädigung des Kleinhirns zu vermeiden, und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn auf eine 60-Millimeter-Schale mit kaltem HBSS und fünf Milligramm pro Milliliter Glukose zu übertragen. Verwenden Sie die geraden Verbandszangen, um das Kleinhirn sorgfältig zu sezieren, und verwenden Sie sterile gekrümmte feine Zangen, um das Gewebe auf eine Kunststoffscheibe auf dem Schneidtisch eines Gewebehäckslers zu legen. Drehen Sie den Schneidtisch, um das Gewebe zu orientieren, um die Erfassung von parasagittalen Abschnitten zu ermöglichen, und ziehen Sie den Tischfreigabeknopf nach rechts, um den Schneidtisch zu bewegen, bis die Klinge am Rand des Gewebes positioniert ist.Passen Sie dann die Scheibendicke auf 350 Mikrometer und die Klingengeschwindigkeit auf Mittel an, und starten Sie den Chopper. Wenn das ganze Kleinhirn in Scheiben geschnitten wurde, schalten Sie den Chopper aus. Mit sterilen Zangen halten Sie die Scheibe über eine neue 60-Millimeter-Schale.Verwenden Sie eine Transferpipette, um HBSS plus Glukose über die Scheibe zu spülen, so dass die Scheiben in die Schale fallen. Wenn Sie dann die Proben so minimal wie möglich berühren, verwenden Sie eine Mikrosonde, um die Scheiben zu trennen. Verwenden Sie die Transferpipette, um Abschnitte des Kleinhirns in der Nähe der Vermis auf einzelne Zellkultureinsätze in der Sechs-Well-Platte auszuwählen, und verwenden Sie die Mikrosonde, um die Scheiben in der Mitte jedes Inserts zu positionieren.Wenn alle Scheiben platziert wurden, saugen Sie sorgfältig überschüssige HBSS plus Glukose an und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Für Die Immunfluoreszenzfärbung entfernen Sie den Überstand aus jedem Brunnen und waschen Sie die Einsätze mit PBS. Fixieren Sie die Scheiben mit einem Milliliter kaltem 4%Paraformaldehyd im Brunnen jedes Einsatzes und 500 Mikroliter auf jedem Einsatz für eine Stunde.Am Ende der Fixierung die Einsätze viermal für 10 Minuten mit einem Milliliter frischer PBS unter jedem Einsatz und 500 Mikroliter frischer PBS auf jedem Einsatz pro Wäsche auf einem Orbital-Shaker waschen. Füllen Sie jeden Brunnen einer 24-Well-Platte mit 500 Mikroliter PBS-TB vor und übertragen Sie mit einem Pinsel die Kleinhirnscheiben aus jedem Zellkultureinsatz in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Permeabilisieren und blockieren Sie die Scheiben bei Raumtemperatur für eine Stunde.Am Ende der Inkubation die Zellen mit 200 Mikrolitern des primären, in PBS-TB verdünnten primären Biots pro Brunnen über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Orbitalshaker beschriften. Am nächsten Morgen die Scheiben viermal für 10 Minuten und 500 Mikroliter frische SB-PBS pro Wäsche auf dem Shaker waschen, bevor sie die Proben mit den entsprechenden fluorophorkonjugierten Sekundärantikörpern zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem Shaker, vor Licht geschützt, beschriften. Am Ende der Inkubation die Abschnitte mit 500 Mikrolitern eines geeigneten Kernflecks pro Brunnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, gegenstainieren.Und verwenden Sie eine Transferpipette, um die Scheiben auf Glasschlitten zu montieren. Dann lassen Sie die Abschnitte vollständig trocknen, bevor Sie mit PBS rehydrieren und die Gewebe mit Abdeckungen beschichten, die mit ca. 80 Mikroliter Montagemedium beschichtet sind. Sobald das Montagemedium ausgehärtet ist, sind die Kleinhirnabschnitte abgefertigt.Am sechsten Tag der Postnatale ist das Überleben der Purkinje-Zellen in den Kontrollproben gering, was mit ihrem bekannten Verwundbarkeitsfenster übereinstimmt. Das Überleben steigt, wenn das Spendertier älter wird und diese kritische Periode beendet. Die Behandlung von Kleinhirnscheiben mit einer hohen Konzentration von Kaliumchlorid führt zu einer erfolgreichen Induktion ihrer Depolarisation und ihres Überlebens.Um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, gesunde Kleinhirnabschnitte auszuwählen und das Kultur-Setup so effizient wie möglich durchzuführen. Postkulturanwendungen gehen über die Immunfluoreszenz hinaus. Als organotypische Scheiben können für Genomproteinexpressionsstudien und zur Überwachung der neuronalen Schaltkreisaktivität mittels Elektrophysiologie und Kalzium-Live-Bildgebung verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...