Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

עבודת הדמיה בוצעה במרכז אוניברסיטת נורת'ווסטרן עבור מיקרוסקופ מתקדם נתמך על ידי NCI CCSG P30 CA060553 הוענק למרכז רוברט ה לוריא מקיף סרטן. אנו מודים לשון מקדרמוט על הסיוע והתמיכה הטכניים שלו, ומאיה אפשטיין לאיורים המוצגים ביד המוצגת באיור 1.

כל הניסויים הכרוכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה ללימודי בעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן.
1. הכנה לפני תרבויות הפרוסה האורגליתית
<ol><li>ב תרבות תא כיסוי מרוסס עם 70% אתנול מראש, להכין 200 mL של מדיום התרבות ב 250 mL בקבוק ואקום העליון מחובר מקלט בקבוק סטרילי. הוסף 100 mL של בסיס בינו?...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

התרבות פרוסה בלבלר הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור מתוכנת Purkinje מתוכנתים המוות במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי במהירות מולקולות מועמד במסך עבור הפוטנציאל הנוירולוגי שלהם. היתרון העיקרי הוא כי ההתקנה היא פשוטה וחסכונית מאוד, והוא רק דורש השקעה צנועה ציוד (משחק הרטט יכול לעלות...

בדוגמנות חוץ גופית הוא כלי חיוני במחקר ביו רפואי. הוא מאפשר לחוקרים ללמוד ולשלוט היטב במנגנונים ספציפיים בסוגי תאים מוגבלים, או במערכות מבודדות/איברים. תרבות הפרוסה האורגנותית היא בשימוש נרחב בטכניקת מבחנה, במיוחד בתחום המוח המדעי1. השיטה הוקמה לראשונה על ידי Gähwiler, אשר מתרבות פרוסות המוח באמצעות טכניקת שפופרת רולר2, ומאוחר יותר שונה על ידי יאממוטו ואח ', מי הציג את השימוש של קרום מיקרונקבובי לבצע תרבויות פרוסה קורטיקלית3. בהשוואה לתרבויות התאים הראשוניים, תרבויות הפרוסה האורגאותיות מציגות את היתרון של שמירה על הארכיטקטורה הציטותאית של הרקמה, כמו גם התקשרויות מקוריות של תאי התא במישור של מקטע הרקמה.
פרוסות אורגאואיות מתורמות מחלקים רבים של מערכת העצבים המרכזית, כגון ההיפוקמפוס4,קליפת 5, סטריאטום6, המוח השני4,7, וחוט השדרה8,9, בין היתר. הם הוכחו להיות כלי רב עוצמה במחקר גילוי סמים10. ההשפעות של מולקולות נוירואקטיביות ניתן להעריך בדרכים רבות: הישרדות וניוון שימוש באמצעות חיסוני וביוכימיה assays, היווצרות מעגלים עצביים, או שיבוש באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה חיה.
מטרת העבודה הזאת היא לתאר שיטה פשוטה לביצוע תרבות פרוסה בצורת אורגנויוגית, שידועה כמודל רלוונטי לחיקוי התפתחות מעשית בתחום החוץ. במיוחד, התמקדנו במחקר של תא מוות התפתחותי של Purkinje. ב vivo, התאים Purkinje עוברים ואפופטוזיס במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, לשיא ביום לאחר הלידה 3 (P3)11. דפוס זהה הוא נצפתה בתרבות פרוסה של המוח, עם נוירונים purkinje מתים על ידי אפופטוזיס כאשר המוח נלקח מבעלי חיים בין P1 ו P8, עם שיא ב P34,12. השימוש בתרביות פרוסה בלבלר מאפשר לזהות מספר מולקולות נוירוגינים7,13, כמו גם הבנת חלק מהמנגנונים המעורבים במוות התאים המתוכנת הזה14,15,16. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על המחקר של סטופיני ואח '17 ב היפוקמפוס, והותאם המוח המהיר על ידי דוארט ואח '4 זה כולל חיתוך מהיר וחיתוך של המוח פוסט לידה; לחתוך את התרבות על הוספת תרבות התא המכיל קרום מיקרונקבובי, עם או בלי טיפול נוירומגן; וכתמים מאימונועצביים כדי להעריך את ההישרדות העצבית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

תרבות הפרוסה האורגנותית היא מודל רב-עוצמה החיקוי לvivo בתנאים הקרובים יותר מאשר בתרבויות תאים ראשיות שאינן מקבילות. בפיתוח מוקדם לאחר הלידה, המוח הפורקיאר Purkinje ידועים לעבור תקופה פגיעה, שבמהלכה הם עוברים מוות תאים מתוכנת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבצע העכבר באמצעות התרבות פרוסה בזמן קריטי זה. הפרוסות מסומנות עוד כדי להעריך את ההישרדות של התאים Purkinje ואת היעילות של טיפולים נוירומגן. שיטה זו יכולה להיות רבת ערך למסך עבור מולקולות נוירואקטיביות חדשות.

כפי שניתן לראות באיור 4, פרוטוקול זה מפיק בתרבויות הפרוסה האורגאולית שבהן ניתן להעריך את הישרדות התאים של Purkinje בעקבות הטיפול הimmunofluorescence ושלבי רכישת התמונה. תאים purkinje סומנו עם שילוב של אנטי Calbindin D-28K (דילול 1/200) ו Alexa594 נגד העכבר (דילול 1/300) נוגדנים. תפרים תמונה נעשה באופן אוטומ?...

Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

תרבות פרוסות אורגנוטיפיק היא כלי רב עוצמה לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ותהליכים ניווניים או רגנרטיביים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לסנן במהירות מולקולות מועמד עבור הפוטנציאל הנוירו-קרן שלהם. שיטה זו מחקה באופן הדוק בתנאי vivo, בהשוואה לתרבויות תאים ראשיים ניתקו, כתוצאה מארכיטקטורת ערכת הרקמות וחיבורי תאי תא מקוריים נשמרים בתוך מישורי המקטעים.כאן אנו מדגימים את המחקר של מוות תאי Purkinje המוח הקטן המתפתח. אבל תרבות פרוסה אורגנותית מתאימה באותה מידה למודל מחלות ניווניות כמעט בכל אזור במערכת העצבים המרכזית. הדגמת ההליך עם ג'ניפר Rakotomamonjy יהיה שון מקדרמוט, טכנאי מהמעבדה שלי.לפני קצירת פרוסות המוח הקטן, בארון ביו-בטיחותי מעוקר, ממלאים כל באר של צלחת תרבות בת שש בארות במיליליטר אחד של מדיום תרבות מסונן ואקום, ומוסיפים את הסוכן הפרמקולוגי המעניין את בארות הטיפול, ונפח שווה של רכב לבארות הבקרה. באמצעות ממטרים סטריליים, מניחים מסנן ממברנה PTFE אחד בגודל 0.4 מיקרומטר מוכנסים לתוך כל באר, דואגים להימנע מבועות בממשק של כל קרום והבינוני, וציידים את המדיום בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. כדי לקצור את המוח הקטן, להשתמש מטליות ההלבשה ישר לתפוס את הראש גור על ידי האף, ולהשתמש מספריים העין ישר לחתוך לפתוח את הקרקפת מהקצה האחורי בצד השני עד קו האמצע.חותכים את הגולגולת באותו אופן, מצביעים על טיפים מספריים כלפי חוץ, כדי למנוע פגיעה במוח הקטן, ולהשתמש מרית להעביר את המוח לצלחת 60 מילימטר המכיל HBSS קר וחמישה מיליגרם למיליליטר של גלוקוז. השתמש מטלפסי ההלבשה ישר לנתח בזהירות את המוח הקטן, ולהשתמש מטלפס דק מעוקל סטרילי למקם את הרקמה על דיסק פלסטיק על שולחן החיתוך של מסוק רקמות. סובב את שולחן החיתוך כדי לכוון את הרקמה כדי לאפשר רכישה של מקטעים parasagittal, ולמשוך את ידית שחרור השולחן ימינה כדי להזיז את שולחן החיתוך עד הלהב ממוקם בקצה הרקמה.לאחר מכן כווננו את עובי הפרוסה ל-350 מיקרומטר, ואת מהירות הלהב לבינונית, והתחלו את המסוק. כאשר כל המוח הקטן נחתך, לכבות את המסוק. באמצעות ממטרים סטריליים, החזק את הדיסק מעל צלחת חדשה של 60 מילימטר.השתמש פיפטה העברה כדי לשטוף HBSS בתוספת גלוקוז על הדיסק, כך הפרוסות ליפול לתוך המנה. לאחר מכן, נוגעים בדגימות בצורה מינימלית ככל האפשר, משתמשים במיקרו-חיידק כדי להפריד בין הפרוסות. השתמש פיפטה העברה כדי לבחור חלקים של המוח הקטן קרוב vermis על תרבות תא בודדים מוסיף בצלחת שש באר, ולהשתמש במיקרופרוב כדי למקם את הפרוסות למרכז של כל הכנס.כאשר כל הפרוסות הונחו, בזהירות שאפו כל HBSS עודף בתוספת גלוקוז, ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. עבור כתמי שפעת חיסונית, להסיר את supernatant מכל באר, ולשטוף את מוסיף עם PBS. תקן את הפרוסות עם מיליליטר אחד של קר 4% paraformaldehyde באר של כל הכנס, ו 500 microliters על גבי כל הכנס במשך שעה אחת.בסוף קיבעון, לשטוף את מוסיף ארבע פעמים במשך 10 דקות עם מיליליטר אחד של PBS טרי תחת כל הכנס ו 500 microliters של PBS טרי על גבי כל הכנס לכל לשטוף על שייקר מסלולית. ממלאים מראש כל באר של צלחת של 24 בארות עם 500 מיקרוליטרים של PBS-TB, ולהשתמש במברשת צבע כדי להעביר את פרוסות המוח הקטן מכל תרבות תא להוסיף לתוך בארות בודדות של צלחת 24 בארות. permeabilize ולחסום את הפרוסות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.בסוף הדגירה, סמן את התאים עם 200 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של עניין מדולל PBS-TB ל הבאר לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית. למחרת בבוקר, לשטוף את הפרוסות ארבע פעמים במשך 10 דקות ו 500 microliters של PBS טרי לכל לשטוף על שייקר, לפני תיוג הדגימות עם נוגדנים משניים פלואורופור משותף המתאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר על השייקר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, נגדי את החלקים עם 500 microliters של כתם גרעיני מתאים לגם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.ולהשתמש פיפטה העברה כדי לטעון את הפרוסות על מגלשות זכוכית. לאחר מכן תן את החלקים אוויר להתייבש לחלוטין לפני התייבשות עם PBS הרכבה את הרקמות עם כיסויים מצופה כ 80 microliters של מדיום הרכבה. לאחר המדיום הרכבה נרפא, החלקים המוח הקטן מוכנים להיות בתמונה.ביום השישי שלאחר הלידה, הישרדות תאי Purkinje נמוכה בדגימות הבקרה, בהתאם לחלון הפגיעות הידוע שלהם. ההישרדות גוברת ככל שהחיה התורמת מתבגרת ויוצאת מתקופה קריטית זו. הטיפול בפרוסות מוחיות עם ריכוז גבוה של אשלגן כלורי גורם אינדוקציה מוצלחת של depolarization שלהם והישרדות.כדי להשיג תוצאות עקביות לשחזור, חשוב מאוד לבחור מקטעים מוחיים בריאים, ולבצע את הגדרת התרבות בצורה יעילה ככל האפשר. יישומים פוסט-תרבותיים חורגים משפעת חיסונית. כמו פרוסות organotypic יכול לשמש למחקרים ביטוי חלבון הגנום, ולניטור פעילות מעגל עצבי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה סידן חי הדמיה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...