Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
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イメージング作業は、ロバートHルーリー総合がんセンターに授与されたNCI CCSG P30 CA060553によって寛大にサポートされているノースウェスタン大学先端顕微鏡センターで行われました。ショーン・マクダーモットの技術支援とサポートに感謝し、図1に示す手描きのイラストに対するマヤ・エプスタインに感謝します。

動物を含むすべての実験は、ノースウェスタン大学動物研究委員会に従って行われた。
1. 組織性小脳スライス培養前の準備
<ol><li>70%エタノールを事前に噴霧した細胞培養フードで、滅菌ボトルレシーバーに取り付けられた250mLボトルトップ真空フィルターで200mLの培養培地を調製します。基底ミディアムイーグル(BME)、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)の50 mL、熱不活性化?...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

小脳スライス培養は、出生後の発達中にプログラムされたプルキンエ細胞死を研究するための強力なツールです。この技術は、その神経保護電位の候補分子を迅速にスクリーニングするために使用することができる。主な利点は、セットアップがシンプルで非常に費用対効果が高く、機器への適度な投資を必要とすること(ビブラートームはティッシュチョッパーの3倍以上のコストがかかる)?...

インビトロモデリングは、生物医学研究に不可欠なツールです。これにより、研究者は、制限された細胞型、または隔離されたシステム/器官内の特定のメカニズムを研究し、厳密に制御することができます。オルガノイトスライス培養は、特に神経科学1の分野で、インビトロ技術で広く使用されている。この方法は、ローラーチューブ技術2を用いて脳スライスを培養したゲーウィラーによって最初に確立され、後に山本らによって改変され、皮質スライス培養を行うために微多孔膜の使用を導入した3。一次細胞培養と比較して、組織皮症スライス培養物は、組織の細胞建築、ならびに組織セクションの平面における天然細胞間接続を維持するという利点を提示する。
組織図スライスは、海馬4、皮質5、線条体6、小脳4、7、および脊髄8、9などの中枢神経系の多くの部分から培養されている。彼らは創薬研究10の強力なツールであることが証明されています。神経活性分子の効果は、免疫染色および生化学アッセイを用いた生存および神経変性、神経回路形成、または電気生理学とライブイメージングを用いた破壊など、多くの方法で評価することができる。
この研究の目的は、小脳の発達をインビトロで模倣する関連モデルであることが知られている組織性小脳スライス培養を行う簡単な方法を記述することです。特に、プルキンエ細胞発達死の研究に着目した。生体内では、プルキンエ細胞は、出生後の最初の週にアポトーシスを受け、出生後3日目(P3)11でピークに達する。小脳スライス培養においても同じパターンが観察され、P1とP8の間の動物からセレベラを採取するとプルキンエニューロンがアポトーシスによって死亡し、ピークはP34、12である。組織性小脳スライス培養物の使用は、いくつかの神経保護分子7、13を同定することを可能にし、ならびにこのプログラムされた細胞死14、15、16に関与するメカニズムの一部を理解することを可能にした。ここでは、海馬におけるStoppiniらの研究に基づくプロトコルを記述し、Dusartら4による小脳に適応した出生後セレベラの急速な解剖および切り刻みが含まれる。神経保護治療の有無にかかわらず、微多孔膜を含む細胞培養インサートに培養をスライスする。および免疫蛍光染色は、神経細胞の生存を評価する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

オルガノチピックスライス培養は、解肉された一次細胞培養よりも近い生体内条件で模倣する強力なインビトロモデルである。出生後の初期の発達では、小脳プルキンジェ細胞は脆弱な期間を経て、その間にプログラムされた細胞死を受けることが知られている。ここでは、この重要な時期にマウスのオルガトイピック小脳スライス培養を実行するための詳細なプロトコルを提供します。スライスはさらにプルキンエ細胞の生存および神経保護処置の有効性を評価するために標識される。この方法は、新しい神経活性分子をスクリーニングするために非常に貴重なことができます。

図4に示すように、このプロトコルは、プルキンエ細胞生存を免疫蛍光および画像取得ステップに従って評価することができる組織図小脳スライス培養物を生成する。プルキンジェ細胞を抗カルビンジンD-28K(希釈1/200)およびAlexa594抗マウス(希釈1/300)抗体の組み合わせで標識した。画像ステッチは、顕微鏡取得ソフトウェア(NIS-Elements)によって自動的に行われ、小脳スライ?...

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Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

オルガノイトスライス培養は、神経発達または変性/再生プロセスを研究するための強力なツールです。ここでは、マウス小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞の神経発達死をモデル化するプロトコルについて説明する。この方法は、神経保護創薬の研究に役立つ可能性があります。.

オルガ鼻記小脳スライス培養におけるプルキンジェ細胞生存

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

オルガノシススライス培養は、神経発達および変性または再生過程を研究するための強力なツールです。この技術は、迅速にそれらの神経保護電位の候補分子をスクリーニングするために使用することができます.この方法は、組織セットアーキテクチャおよびネイティブ細胞結合がセクションの平面内に保存されるため、解約された一次細胞培養物と比較して、生体内の状態を密接に模倣する。ここでは、発達中の小脳におけるプルキンエ細胞死の研究を示す。しかし、オルガノシスのスライス培養は、ほぼすべての中枢神経系領域における神経変性疾患をモデル化するのに同様に適している。ジェニファー・ラコトマモンジとの手順を実証するのは、私の研究室の技術者ショーン・マクダーモットです。小脳スライスを収穫する前に、滅菌されたバイオセーフティキャビネットで、6ウェル培養プレートの各ウェルを1ミリリットルの真空濾過培養培地で満たし、目的の薬理剤を治療井戸に加え、同量の車両を制御井戸に加える。滅菌鉗子を使用して、各ウェルに1つの0.4マイクロメートルの孔サイズPTFE膜フィルターインサートを置き、各膜と媒体の界面で気泡を避け、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターで2時間平衡化します。小脳を収穫するには、ストレートドレッシング鉗子を使用して鼻で子犬の頭をつかみ、まっすぐなアイハサミを使用して後端から正中線に頭皮を切り開きます。小脳に損傷を与えないように、はさみの先端を外側に向けて頭蓋骨を切り開き、ヘラを使って冷たいHBSSとグルコース1ミリリットル当たり5ミリグラムを含む60ミリメートル皿に脳を移す。ストレートドレッシング鉗子を使用して小脳を慎重に解剖し、滅菌湾曲した細かい鉗子を使用して組織チョッパーの切断テーブルのプラスチックディスクに組織を置きます。切断テーブルを回転させて、パラサジタル切片の獲得を可能にする組織の向きを変え、ブレードが組織の端に配置されるまで、テーブルリリースノブを右に引いて切断テーブルを移動させます。その後、スライスの厚さを350マイクロメートルに調整し、ブレードの速度を中程度に調整し、チョッパーを開始します。小脳全体がスライスされたら、チョッパーをオフにします。滅菌鉗子を使用して、新しい60ミリメートル皿の上にディスクを保持します。スライスが皿に落ちるようにディスク上のHBSSプラスグルコースを洗い流すために転送ピペットを使用してください。次に、サンプルをできるだけ最小限に触れ、マイクロプローブを使用してスライスを分離します。トランスファーピペットを使用して、ベルミに近い小脳のセクションを6ウェルプレートの個々の細胞培養挿入物に選択し、マイクロプローブを使用して各インサートの中央にスライスを配置します。すべてのスライスが配置されたら、余分なHBSSとグルコースを慎重に吸引し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。免疫蛍光染色の場合は、各ウェルから上清を取り除き、挿入物をPBSで洗浄します。各インサートのウェルに冷たい4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットル、1時間の各挿入物の上に500マイクロリットルでスライスを固定します。固定の終わりに、各挿入物の下に新鮮なPBSの1ミリリットルと軌道シェーカー上の各洗浄ごとに各挿入物の上に新鮮なPBSの500マイクロリットルで10分間4回挿入物を洗浄します。24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルのPBS-TBを事前に充填し、ペイントブラシを使用して各細胞培養インサートの小脳スライスを24ウェルプレートの個々のウェルに移します。室温でスライスを1時間透過してブロックします。インキュベーションの終わりに、細胞に、軌道シェーカーの摂氏4度で一晩PBS-TBで希釈された目的の一次抗体の200マイクロリットルで細胞にラベルを付ける。翌朝、シェーカーで1回10分間スライスを10分間洗浄し、500マイクロリットルの新鮮なPBSを洗浄してから、サンプルに適切なフルオロフォア共役二次抗体をシェーカーの室温で2時間標識し、光から保護する。インキュベーションの終わりに、光から保護された室温で10分間、ウェルあたり500マイクロリットルの適切な核染色を有するセクションに対抗する。そして、ガラスのスライドにスライスをマウントするために転送ピペットを使用しています。その後、PBSで水分補給し、約80マイクロリットルの取り付け媒体でコーティングされたカバーリップで組織を取り付ける前に、セクションを完全に乾燥させます。取り付け媒体が硬化したら、小脳部はイメージ化する準備ができている。出生後6日目には、プルキンエ細胞の生存率は対照サンプルにおいて低く、既知の脆弱性ウィンドウと一致する。ドナー動物が高齢になり、この重要な期間を終了するにつれて生存率が増加します。塩化カリウムの高濃度で小脳スライスの治療は、それらの脱分極と生存の誘導に成功をもたらす。一貫した再現性のある結果を得るためには、健康な小脳部を選択し、培養を可能な限り効率的に行うことが重要です。培養後のアプリケーションは、免疫蛍光を超えています。organotypicスライスは、ゲノムタンパク質発現研究、および電気生理学およびカルシウムライブイメージングを用いた神経回路活動のモニタリングに使用することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

器官小脳文化：アポトーシス課題と検出

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

L-ロイシンメチルエステルを使用した小脳顆粒細胞培養物からのミクログリアの選択的枯渇

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...