Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Imaging arbeidet ble utført ved Northwestern University Center for Advanced mikroskopi sjenerøst støttet av NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for sin tekniske assistanse og støtte, og Maya Epstein for hånd-tegnet illustrasjoner vist i figur 1.

Alle eksperimenter som involverer dyr ble utført i samsvar med Northwestern University Animal Studies Committee.
1. forberedelse før organotypic lillehjernen sektor kulturer
<ol><li>I en cellekultur hette sprayet med 70% etanol på forhånd, forberede 200 mL kultur medium i et 250 mL flaske-Top vakuum filterfestet til en steril flaske mottaker. Tilsett 100 mL av basal medium Eagle (BME), 50 mL av Hanks balanserte salt løsning (HBSS), 50 mL varme deaktivert heste serum, 1 mL 200 mM L-gluta...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

Lillehjernen Slice kultur er et kraftig verktøy for å studere programmert Purkinje celle død under postnatal utvikling. Denne teknikken kan brukes til å raskt skjermen kandidat molekyler for deres nervecellene potensial. Den største fordelen er at oppsettet er enkelt og svært kostnadseffektivt, og krever bare en beskjeden investering i utstyr (en vibratome kan koste opptil 3 ganger mer enn et vev helikopter). Dessuten, 10 å 15 rask skive kan utviklet fra ettall musen pup, tillater for annerledes analyser å bli ut...

In vitro modellering er et viktig verktøy i biomedisinsk forskning. Det gjør at etterforskerne å studere og tett kontroll spesifikke mekanismer i begrensede celletyper, eller i isolerte systemer/organer. Organotypic Slice kultur er en mye brukt in vitro teknikk, spesielt innen nevrovitenskap1. Metoden ble først etablert av Gähwiler, som kultivert hjerne skiver ved hjelp av valsen tube teknikk2, og senere endret av Yamamoto et al., som introduserte bruk av en mikroporøse membran for å utføre kortikale Slice kulturer3. Sammenlignet med primær cellekulturer, organotypic skjære kulturer presentere fordelen av å bevare cytoarchitecture av vevet, samt native celle-celle-tilkoblinger i planet av vevet delen.
Organotypic skiver har blitt kultivert fra mange deler av det sentrale nervesystemet, slik som hippocampus4, cortex5, striatum6, lillehjernen4,7og ryggmarg8,9, blant andre. De har vist seg å være et kraftig verktøy i stoffet funnet studier10. Virkningene av neuroactive molekyler kan vurderes på mange måter: overlevelse og neurodegeneration ved hjelp av immunostaining og biokjemi analyser, neuronal krets formasjon, eller forstyrrelse ved hjelp av elektrofysiologi og live-Imaging.
Målet med dette arbeidet er å beskrive en enkel metode for å utføre organotypic lillehjernen skive kultur, som er kjent for å være en relevant modell for å etterligne lillehjernen utvikling in vitro. Spesielt fokuserte vi på studiet av Purkinje celle utviklings død. In vivo, Purkinje celler gjennomgår apoptose i løpet av den første postnatal uken, med topp på postnatal dag 3 (P3)11. Det samme mønsteret er observert i lillehjernen Slice kultur, med Purkinje neurons døende av apoptose når cerebella er Hentet fra dyr mellom P1 og P8, med en topp på P34,12. Bruken av organotypic lillehjernen skive kulturer har lov til å identifisere flere nervecellene molekyler7,13, samt forstå en del av mekanismene som er involvert i denne programmerte cellen død14,15,16. Her beskriver vi en protokoll basert på studiet av Stoppini et al.17 i hippocampus, og tilpasset lillehjernen av Dusart et al.4 den inkluderer Rapid disseksjon og hakking av postnatal cerebella; kutting kultur på en cellekultur innsats som inneholder en mikroporøse membran, med eller uten nervecellene behandling; og immunofluorescence flekker å vurdere neuronal overlevelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

Organotypic Slice-kultur er en kraftig in vitro-modell som mimicks in vivo-tilstander tettere enn dissosiert primær cellekulturer. I tidlig postnatal utvikling, lillehjernen Purkinje celler er kjent for å gå gjennom en sårbar periode, der de gjennomgår programmert celle død. Her gir vi en detaljert protokoll for å utføre musen organotypic lillehjernen Slice kultur i denne kritiske tiden. Skivene er videre merket for å vurdere Purkinje celle overlevelse og effekten av nervecellene behandlinger. Denne metoden kan være svært verdifull for skjermen for nye neuroactive molekyler.

Som vist i Figur 4, produserer denne protokollen organotypic lillehjernen skive kulturer der Purkinje celle overlevelse kan vurderes etter immunofluorescence og bilde oppkjøpet trinn. Purkinje celler ble merket med en kombinasjon av anti-Calbindin D-28K (fortynning 1/200) og Alexa594 anti-mus (fortynning 1/300) antistoffer. Image søm ble gjort automatisk av mikroskop oppkjøpet programvare (NIS-Elements) for å få et bilde av hele lillehjernen skive. Purkinje celle tall per skive ble lagt...

Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic skive kulturer er et kraftig verktøy for å studere neurodevelopmental eller degenerative/regenererende prosesser. Her beskriver vi en protokoll som modeller den neurodevelopmental død Purkinje celler i mus lillehjernen skive kulturer. Denne metoden kan ha nytte forskning i nervecellene narkotika funn.

Purkinje Cell Survival i Organotypic lillehjernen Slice kulturer

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotypisk skivekultur er et kraftig verktøy for å studere nevroutvikling og degenerative eller regenerative prosesser. Denne teknikken kan brukes til å raskt screene kandidatmolekyler for deres nevrobeskyttende potensial. Denne metoden etterligner nøye in vivo forhold, sammenlignet med dissosierte primære cellekulturer, da vevssettarkitekturen og innfødte cellecelleforbindelser bevares i flyene i seksjonene.Her demonstrerer vi studiet av Purkinje celledød i det utviklende lillehjernen. Men organotypisk skivekultur er like egnet til å modellere nevrodegenerative sykdommer i nesten alle sentralnervesystemets region. Å demonstrere prosedyren med Jennifer Rakotomamonjy vil være Sean McDermott, en tekniker fra laboratoriet mitt.Før høsting av lillehjernen skiver, i et sterilisert biosikkerhetskap, fylle hver brønn av en seks-brønns kultur plate med en milliliter vakuumfiltrert kultur medium, og legge til farmakologisk middel av interesse for behandling brønner, og et likt volum av kjøretøy til kontrollbrønnene. Bruk sterile tang, plasser en 0,4-mikrometer porestørrelse PTFE membranfilter sett inn i hver brønn, ta vare på å unngå bobler i grensesnittet til hver membran og mediet, og likevekt mediet i en 37 grader Celsius og 5% karbondioksid inkubator i to timer. For å høste lillehjernen, bruk rette dressingtang for å gripe valphodet ved nesen, og bruk rett øyesaks for å kutte åpne hodebunnen fra den bakre enden sideveis til midtlinjen.Klipp opp skallen på samme måte, pek saksetipsene utover for å unngå å skade lillehjernen, og bruk en slikkepott til å overføre hjernen til en 60-millimeters tallerken som inneholder kald HBSS og fem milligram per milliliter glukose. Bruk de rette dressing tang til å forsiktig dissekere ut lillehjernen, og bruk sterile buede fine tang for å plassere vevet på en plastplate på skjærebordet til et vevshelikopter. Roter skjærebordet for å orientere vevet for å tillate oppkjøp av parasagittale seksjoner, og trekk bordutløsningsknappen til høyre for å flytte skjærebordet til bladet er plassert på kanten av vevet.Juster deretter skivetykkelsen til 350 mikrometer, og bladhastigheten til middels, og start helikopteret. Når hele lillehjernen er skåret, slå av helikopteret. Bruk sterile tang, hold platen over en ny 60-millimeters tallerken.Bruk en overføringspipette til å skylle HBSS pluss glukose over platen slik at skivene faller ned i fatet. Deretter berører du prøvene så minimalt som mulig, bruk en mikroprobe til å skille skivene. Bruk overføringspipetten til å velge deler av lillehjernen nær vermis på individuelle cellekulturinnlegg i seksbrønnsplaten, og bruk mikroprobenet til å plassere skivene i midten av hvert innlegg.Når alle skivene er plassert, aspirerer forsiktig overflødig HBSS pluss glukose, og returnerer platen til cellekulturinkubatoren. For immunofluorescence farging, fjern supernatant fra hver brønn, og vask innsatsene med PBS. Fest skivene med en milliliter kald 4% paraformaldehyd i brønnen på hvert innlegg, og 500 mikroliter på toppen av hvert innlegg i en time.På slutten av fikseringen vasker du innsatsene fire ganger i 10 minutter med en milliliter frisk PBS under hvert innlegg og 500 mikroliter med ferske PBS på toppen av hver innsats per vask på en orbital shaker. Fyll hver brønn på en 24-brønns plate med 500 mikroliter PBS-TB, og bruk en pensel til å overføre lillehjernenskiver fra hver cellekulturinnsats til individuelle brønner på en 24-brønns plate. Gjennomsyre og blokkere skivene ved romtemperatur i en time.På slutten av inkubasjonen, merk cellene med 200 mikroliter av det primære antistoffet av interesse fortynnet i PBS-TB per brønn over natten ved fire grader Celsius på orbital shaker. Neste morgen vask skivene fire ganger i 10 minutter og 500 mikroliter frisk PBS per vask på shakeren, før du merker prøvene med de riktige fluoroforkonjugerte sekundære antistoffene i to timer ved romtemperatur på shakeren, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, motvirke seksjonene med 500 mikroliter av en passende kjernefysisk flekk per brønn i 10 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.Og bruk en overføringspipette til å montere skivene på glasssklier. La deretter seksjonene lufttørke helt før de rehydrerer med PBS og monterer vevet med dekkglass belagt med ca. 80 mikroliter monteringsmedium. Når monteringsmediet er herdet, er lillehjernen seksjoner klare til å bli avbildet.På postnatal dag seks er Purkinje celleoverlevelse lav i kontrollprøvene, i samsvar med deres kjente sårbarhetsvindu. Overlevelsen øker etter hvert som donordyret blir eldre og går ut av denne kritiske perioden. Behandlingen av lillehjernen skiver med en høy konsentrasjon av kaliumklorid resulterer i vellykket induksjon av deres depolarisering og overlevelse.For å oppnå konsistente og reproduserbare resultater er det viktig å velge sunne lillehjernseksjoner, og å utføre kulturoppsettet så effektivt som mulig. Etterkulturen går søknader utover immunofluorescence. Som organotypiske skiver kan brukes til genomproteinuttrykksstudier, og for overvåking av nevronal kretsaktivitet ved hjelp av elektrofysiologi og kalsium levende avbildning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonale Ventral midthjernen: Et system for å Study dopaminerge neuronal Development In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-embedding immunogold merking av Synaptic Proteiner i hippocampus Slice kulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic skive kulturer til å studere oligodendrocyte Dynamics og myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen av Neurokar ombygging i Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Selektiv Nedbryting av Microglia fra Cerebellar granulat cellekulturer ved hjelp av L-leucin MetylEster

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...