Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
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O trabalho de imagem foi realizado no Northwestern University Center for Advanced Microscopy generosamente apoiado pela NCI CCSG P30 CA060553 concedida ao Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Agradecemos a Sean McDermott por sua assistência técnica e apoio, e Maya Epstein para as ilustrações desenhadas à mão mostrado na Figura 1.

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o comitê de Estudos em Animais da Northwestern University.
1. Preparação antes das culturas organotípicas de fatiacerebelares
<ol><li>Em uma capa de cultura celular pulverizada com 70% de etanol de antemão, prepare 200 mL de meio de cultura em um filtro de vácuo de 250 mL mL ligado a um receptor de garrafa estéril. Adicione 100 mL de Basal Medium Eagle (BME), 50 mL de Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 50 mL de...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

A cultura cerebellar da fatia é uma ferramenta poderosa para estudar a morte programada da pilha de Purkinje durante o desenvolvimento postnatal. Esta técnica pode ser usada para selecionar rapidamente moléculas candidatas para seu potencial neuroprotetor. A principal vantagem é que a configuração é simples e muito rentável, e requer apenas um investimento modesto em equipamentos (um vibratome pode custar até 3 vezes mais do que um helicóptero de tecido). Além disso, 10 a 15 fatias saudáveis podem ser geradas...

A modelagem in vitro é uma ferramenta essencial na pesquisa biomédica. Ele permite que os investigadores para estudar e controlar rigorosamente mecanismos específicos em tipos de células restritas, ou em sistemas isolados / órgãos. A cultura organotípica da fatia é uma técnica in vitro amplamente utilizada, especial no campo da neurociência1. O método foi estabelecido pela primeira vez por Gähwiler, que cultou fatias cerebrais usando a técnica de tubo de rolo2,e mais tarde modificado por Yamamoto et al., que introduziu o uso de uma membrana microporosa para realizar culturas de fatias corticais3. Em comparação com as culturas celulares primárias, as culturas organotípicas apresentam a vantagem de preservar a citoarquitetura do tecido, bem como as conexões células-células nativas no plano da seção de tecido.
As fatias organotípicas foram cultivadas a partir de muitas partes do sistema nervoso central, como o hipocampo4,córtex5,estriado6,cerebelo4,7,e medula espinhal8,9,entre outros. Eles foram provados para ser uma ferramenta poderosa na descoberta de drogas estudos10. Os efeitos das moléculas neuroativas podem ser avaliados de muitas maneiras: sobrevivência e neurodegeneração usando imunomanchas e bioquímica, formação de circuito neuronal ou interrupção usando eletrofisiologia e imagem viva.
O objetivo deste trabalho é descrever um método simples para realizar a cultura cerebellar organotypic da fatia, que é sabida para ser um modelo relevante para imitar o desenvolvimento cerebellar in vitro. Particularmente, nós focalizamos no estudo da morte desenvolvente da pilha de Purkinje. In vivo, as células de Purkinje passam por apoptose durante a primeira semana pós-natal, atingindo o pico no dia pós-natal 3 (P3)11. O mesmo padrão é observado na cultura cerebellar fatia, com neurônios Purkinje morrendo por apoptose quando cerebella são retirados de animais entre P1 e P8, com um pico de P34,12. O uso das culturas organotípicas de fatiacerebelares permitiu identificar várias moléculas neuroprotetoras7,13,bem como compreender parte dos mecanismos envolvidos nesta morte celular programada14,15,16. Aqui, descrevemos um protocolo baseado no estudo de Stoppini et al.17 no hipocampo, e adaptado ao cerebelo por Dusart et al.4 Inclui dissecação rápida e corte de cerebella pós-natal; cortar a cultura em uma inserção da cultura celular contendo uma membrana microporosa, com ou sem tratamento neuroprotetor; e imunofluorescência manchando para avaliar a sobrevivência neuronal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

A cultura organotípica da fatia é um modelo in vitro poderoso que imite em condições do vivo mais pròxima do que culturas dissociadas da pilha preliminar. No desenvolvimento pós-natal inicial, as células cerebelares de Purkinje são conhecidas por passar por um período vulnerável, durante o qual passam por morte celular programada. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar a cultura de fatiacerebelar organotípica do mouse durante este momento crítico. As fatias são ainda mais rotuladas para avaliar a sobrevivência celular de Purkinje e a eficácia de tratamentos neuroprotetores. Este método pode ser extremamente valioso para a tela para novas moléculas neuroativas.

Como mostrado na Figura 4,este protocolo produz culturas organotípicas de fatiacerebelares nas quais a sobrevivência celular de Purkinje pode ser avaliada após as etapas de imunofluorescência e aquisição de imagem. As células purkinje foram rotuladas com uma combinação de anticorpos anticalbindin d-28K (diluição 1/200) e anti-rato Alexa594 (diluição 1/300). A costura da imagem foi feita automaticamente pelo software da aquisição do microscópio (NIS-Elementos) para obter um re...

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Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.

Purkinje Sobrevivência celular em culturas organotípicas cerebelares fatia

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

A cultura de fatia organotípica é uma poderosa ferramenta para estudar processos neurodesenvolvimentantes e degenerativos ou regenerativos. Esta técnica pode ser usada para testar rapidamente moléculas candidatas para seu potencial neuroprotetor. Este método imita de perto as condições in vivo, em comparação com as culturas celulares primárias dissociadas, à medida que a arquitetura do conjunto tecidual e as conexões células nativas são preservadas dentro dos planos das seções.Aqui demonstramos o estudo da morte celular de Purkinje no cerebelo em desenvolvimento. Mas a cultura de fatia organotípica é igualmente adequada para modelar doenças neurodegenerativas em quase todas as regiões do sistema nervoso central. Demonstrando o procedimento com Jennifer Rakotomamonjy estará Sean McDermott, um técnico do meu laboratório.Antes de colher as fatias cerebelares, em um armário de biossegurança esterilizado, preencha cada poço de uma placa de seis poços de cultura com um mililitro de meio de cultura filtrada a vácuo, e adicione o agente farmacológico de interesse aos poços de tratamento, e um volume igual de veículo aos poços de controle. Usando fórceps estéreis, coloque um filtro de membrana PTFE tamanho 0,4 micrômetro em cada poço, tomando cuidado para evitar bolhas na interface de cada membrana e do meio, e equilibre o meio em uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius e 5% por duas horas. Para colher o cerebelo, use fórceps de curativo reto para agarrar a cabeça do filhote pelo nariz, e use uma tesoura de olho reto para cortar o couro cabeludo da extremidade posterior lateralmente para a linha média.Corte o crânio da mesma maneira, apontando as pontas da tesoura para fora para evitar danificar o cerebelo, e use uma espátula para transferir o cérebro para um prato de 60 milímetros contendo HBSS frio e cinco miligramas por mililitro de glicose. Use os fórceps de curativo reto para dissecar cuidadosamente o cerebelo e use fórceps finos estéreis para colocar o tecido em um disco plástico na mesa de corte de um helicóptero de tecido. Gire a mesa de corte para orientar o tecido para permitir a aquisição de seções parasagitais e puxe o botão de liberação da mesa para a direita para mover a mesa de corte até que a lâmina esteja posicionada na borda do tecido.Em seguida, ajuste a espessura da fatia para 350 micrômetros, e a velocidade da lâmina para médio, e ligue o helicóptero. Quando todo o cerebelo tiver sido cortado, desligue o helicóptero. Usando fórceps estéreis, segure o disco sobre um novo prato de 60 milímetros.Use uma pipeta de transferência para lavar o HBSS mais a glicose sobre o disco para que as fatias caiam no prato. Em seguida, tocando as amostras o mínimo possível, use um microprobe para separar as fatias. Use a pipeta de transferência para selecionar seções do cerebelo perto do vermímis em pastilhas de cultura celular individuais na placa de seis poços e use o microprobe para posicionar as fatias no centro de cada inserção.Quando todas as fatias tiverem sido colocadas, aspire cuidadosamente qualquer excesso de HBSS mais glicose, e devolva a placa à incubadora de cultura celular. Para coloração de imunofluorescência, remova o sobrenante de cada poço e lave as pastilhas com PBS. Fixar as fatias com um mililitro de paraformaldeído frio de 4% no poço de cada inserção, e 500 microliters em cima de cada inserção por uma hora.No final da fixação, lave as pastilhas quatro vezes por 10 minutos com um mililitro de PBS fresco sob cada inserção e 500 microliters de PBS frescos em cima de cada inserção por lavagem em um agitador orbital. Preencha cada poço de uma placa de 24 poços com 500 microliters de PBS-TB, e use um pincel para transferir as fatias cerebelares de cada inserção de cultura celular em poços individuais de uma placa de 24 poços. Permeabilize e bloqueie as fatias em temperatura ambiente por uma hora.No final da incubação, rotule as células com 200 microliters do anticorpo primário de interesse diluído em PBS-TB por poço durante a noite a quatro graus Celsius no shaker orbital. Na manhã seguinte, lave as fatias quatro vezes por 10 minutos e 500 microliters de PBS fresco por lavagem no shaker, antes de rotular as amostras com os anticorpos secundários conjugados fluoróvo apropriados por duas horas à temperatura ambiente no agitador, protegidos da luz. No final da incubação, contra-acerte as seções com 500 microliters de uma mancha nuclear apropriada por poço por 10 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz.E use uma pipeta de transferência para montar as fatias em lâminas de vidro. Em seguida, deixe as seções secarem completamente antes de reidratar com PBS e montar os tecidos com tampas revestidas com aproximadamente 80 microliters de meio de montagem. Uma vez que o meio de montagem tenha curado, as seções cerebelares estão prontas para serem imagens.No sexto dia pós-natal, a sobrevivência das células Purkinje é baixa nas amostras de controle, consistente com sua conhecida janela de vulnerabilidade. A sobrevivência aumenta à medida que o animal doador envelhece e sai desse período crítico. O tratamento de fatias cerebelares com alta concentração de cloreto de potássio resulta em indução bem sucedida de sua despolarização e sobrevivência.Para obter resultados consistentes e reprodutíveis, é fundamental selecionar seções cerebelares saudáveis e realizar a configuração da cultura da forma mais eficiente possível. As aplicações pós-cultura vão além da imunofluorescência. Como fatias organotípicas podem ser usadas para estudos de expressão de proteínas do genoma, e para monitorar a atividade do circuito neuronal usando eletrofisiologia e imagem viva de cálcio.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Neurociência

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...