Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Imaging работы были выполнены в Северо-Западном университете Центр расширенной микроскопии щедро поддерживается NCI CCSG P30 CA060553 присуждается Роберт H Lurie Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим Шона Макдермотта за его техническую помощь и поддержку, а Майю Эпштейн за рисованные иллюстрации, показанные на рисунке 1.

Все эксперименты с участием животных проводились в соответствии с комитетом По изучению животных Северо-Западного университета.
1. Подготовка до органотипической мозжечковой культуры ломтик
<ol><li>В клеточной культуре капот распыляется с 70% этанола заранее, подготовить ...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

Церебелля среза культура является мощным инструментом для изучения запрограммированных Purkinje смерти клеток во время послеродового развития. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекулы кандидатов на их нейропротекторный потенциал. Основным преимуществом является ?...

Моделирование in vitro является важным инструментом в биомедицинских исследованиях. Это позволяет следователям изучать и жестко контролировать конкретные механизмы в ограниченных типов клеток, или в изолированных системах / органах. Органотипическая срезная культура широко используется в пробирке техника, особенно в области неврологии1. Метод был впервые создан Гюхвилер, который культивируется мозг ломтиками с помощью роликовой трубки техники2, а затем изменены Ямамото и др., который ввел использование микропористых мембраны для выполнения корковых культур ломтик3. По сравнению с первичными культурами клеток, органотипические срезные культуры представляют собой преимущество сохранения цитоархитектуры ткани, а также родных клеточных соединений в плоскости ткани.
Органотипические ломтики были культивированы из многих частей центральной нервной системы, таких как гиппокамп4,кора5,стриатум6,мозжечок4,7,и спинной мозг 8,9, среди других. Они были доказаны, чтобы быть мощным инструментом в исследованиях открытия наркотиков10. Эффекты нейроактивных молекул можно оценить по-разному: выживание и нейродегенерация с помощью иммуностоинга и биохимии анализов, формирования нейрональных цепей, или нарушения с помощью электрофизиологии и живой визуализации.
Цель этой работы состоит в том, чтобы описать простой метод для выполнения органотипической мозжечковой культуры ломтик, который, как известно, соответствующая модель для имитации мозжечкового развития в пробирке. В частности, мы сосредоточились на изучении смерти клеток Пуркинье. In vivo, Purkinje клетки проходят апоптоз в течение первой послеродовой недели, достигнув пика в послеродовой день 3 (P3)11. Такая же картина наблюдается в мозжечковой культуры ломтик, с Purkinje нейронов умирают от апоптоза, когда церебелла взяты из животных между P1 и P8, с пиком на P34,12. Использование органотипических мозжечковых культур ломтик позволило определить несколько нейропротекторных молекул7,13, а также понимание части механизмов, участвующих в этой запрограммированной клеточной смерти14,15,16. Здесь мы описываем протокол, основанный на изучении Stoppini et al.17 в гиппокампе, и адаптированный к мозжечке Dusart et al.4 Он включает в себя быстрое вскрытие и измельчение послеродовой церебелли; нарезка культуры на вставку клеточной культуры, содержащая микропористую мембрану, с нейропротекторным лечением или без нее; и иммунофлуоресценции окрашивания для оценки выживаемости нейронов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

Organotypic срез культуры является мощным in vitro модель, которая имитирует в условиях vivo более тесно, чем разъединенных первичных культур клеток. В начале послеродового развития, мозжечковые клетки Purkinje, как известно, проходят через уязвимый период, в течение которого они претерпевают запрограммированную гибель клеток. Здесь мы предоставляем подробный протокол для выполнения мыши organotypic мозжечковой культуры ломтик в это критическое время. Ломтики дополнительно помечены для оценки выживания клеток Пуркинье и эффективности нейропротекторных методов лечения. Этот метод может быть чрезвычайно ценным для проверки новых нейроактивных молекул.

Как показано на рисунке 4, этот протокол производит органотипические мозжечковые срез культуры, в которых purkinje выживания клеток может быть оценена после иммунофлуоресценции и изображения приобретения шагов. Клетки Пуркинье были помечены комбинацией антикальбиндина D-...

Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Органотипические срезные культуры являются мощным инструментом для изучения нейроразвития или дегенеративных / регенеративных процессов. Здесь мы описываем протокол, который моделирует нейроразвитие смерти клеток Purkinje в мыши мозжечковой культуры ломтик. Этот метод может принести пользу исследованиям в нейропротекторных открытий наркотиков.

Purkinje Cell выживания в органотипической церебеллярной части культур

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Органотипическая культура ломтика является мощным инструментом для изучения нейроразвития и дегенеративных или регенеративных процессов. Этот метод может быть использован для быстрого экрана молекул кандидата для их нейропротекторного потенциала. Этот метод тесно имитирует условия in vivo, по сравнению с диссоциированными культурами первичных клеток, так как архитектура тканей и родных клеточных соединений сохраняются в плоскостях секций.Здесь мы демонстрируем изучение смерти клеток Пуркинье в развивающемся мозжечках. Но органотипическая культура ломтика одинаково подходит для моделирования нейродегенеративных заболеваний почти в каждом регионе центральной нервной системы. Демонстрацией процедуры с Дженнифер Ракотомамонджи будет Шон МакДермотт, техник из моей лаборатории.Перед сбором мозжечковых ломтиков, в стерилизованный шкаф биобезопасности, заполнить каждый колодец из шести скважин культуры пластины с одним миллилитр вакуумной фильтрованной среды культуры, и добавить фармакологический агент интерес для обработки скважин, и равный объем транспортного средства для управления скважин. Используя стерильные тибры, поместите один 0,4-микрометровый поры размером PTFE мембранный фильтр вставить в каждую колодец, заботясь, чтобы избежать пузырьков на стыке каждой мембраны и среды, и уравночные среды в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа инкубатор в течение двух часов. Чтобы собрать мозжечок, используйте прямые миппы для вязки, чтобы схватить щенка за нос, и использовать ножницы для прямых глаз, чтобы разрезать кожу головы от заднего конца боковой до средней линии.Разрежьте череп таким же образом, указывая ножницами советы наружу, чтобы избежать повреждения мозжечка, и использовать шпатель для передачи мозга на 60-миллиметровое блюдо, содержащее холодный HBSS и пять миллиграммов на миллилитр глюкозы. Используйте прямые вязки соусом, чтобы тщательно вскрыть мозжечок, и использовать стерильные изогнутые тонкие миппы, чтобы поместить ткань на пластиковый диск на режущей таблице измельчителя ткани. Поверните режущие таблицы, чтобы сориентировать ткань, чтобы приобретение паразагиттальных секций, и потяните ручку выпуска стола вправо, чтобы переместить режущей стол, пока лезвие не будет расположено на краю ткани.Затем отрегулируйте толщину ломтика до 350 микрометров, а скорость лезвия до средней, и запустите вертолет. Когда весь мозжечок будет разрезан, выключите вертолет. Используя стерильные типсы, держите диск над новым 60-миллиметровым блюдом.Используйте передачу пипетки, чтобы промыть HBSS плюс глюкозу над диском, так что ломтики попадают в блюдо. Затем, касаясь образцов как можно меньше, используйте микропроб, чтобы отделить ломтики. Используйте передачу пипетки, чтобы выбрать разделы мозжечка близко к верме на отдельные вставки культуры клеток в шесть хорошо пластины, и использовать микропроб для позиционирования ломтиков в центре каждой вставки.Когда все ломтики были помещены, тщательно аспирировать любые излишки HBSS плюс глюкоза, и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Для окрашивания иммунофторесценции, удалить супернатант из каждого хорошо, и мыть вставки с PBS. Зафиксировать ломтики с одним миллилитров холодного 4%paraformaldehyde в хорошо каждой вставки, и 500 микролитров на верхней части каждой вставки в течение одного часа.В конце фиксации, мыть вставки четыре раза в течение 10 минут с одним миллилитров свежего PBS под каждой вставкой и 500 микролитров свежего PBS поверх каждой вставки на стирку на орбитальном шейкере. Предварительно заполните каждый колодец 24-хорошо пластины с 500 микролитров PBS-TB, и использовать кисть для передачи мозжечковых ломтиков из каждой клеточной культуры вставить в отдельные колодцы 24-хорошо пластины. Permeabilize и блокировать ломтики при комнатной температуре в течение одного часа.В конце инкубации, этикетка клеток с 200 микролитров первичного антитела интерес разбавленной в PBS-TB на ночь при четырех градусах по Цельсию на орбитальном шейкере. На следующее утро, мыть ломтики четыре раза в течение 10 минут и 500 микролитров свежего PBS на стирку на шейкере, прежде чем маркировать образцы с соответствующими фторфор-конъюгированных вторичных антител в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере, защищенный от света. В конце инкубации счетчики с 500 микролитров соответствующего ядерного пятна на колодец в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенные от света.И использовать передачу пипетки для установки ломтиков на стеклянные горки. Затем дайте секциям полностью высохнуть перед регидратанием с помощью PBS и монтажом тканей с крышками, покрытыми примерно 80 микролитров монтажной среды. После того, как монтажная среда вылечилась, мозжечковые секции готовы к изображению.На послеродовой шестой день выживаемость клеток Пуркинье низка в контрольных образцах, что соответствует их известному окну уязвимости. Выживаемость увеличивается по мере того, как животное-донор стареет и выходит из этого критического периода. Лечение мозжечковых ломтиков с высокой концентрацией хлорида калия приводит к успешной индукции их деполяризации и выживания.Для получения последовательных и воспроизводимых результатов крайне важно выбрать здоровые мозжечковые секции и как можно более эффективно выполнять настройку культуры. Пост-культурные приложения выходят за рамки иммунофлуоресценции. Как органотипические ломтики могут быть использованы для исследования экспрессии белка генома, а также для мониторинга активности нейрональной цепи с использованием электрофизиологии и живой визуализации кальция.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Органотипической культуре Кусочек GFP-экспрессирующих эмбрионов мыши для реального времени изображений периферической нервной вырост

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

После вложения Immunogold маркировки синаптические белки в гиппокампе культур Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...