Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
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El trabajo por imágenes se realizó en el Northwestern University Center for Advanced Microscopy con el apoyo generoso de NCI CCSG P30 CA060553 otorgado al Centro Integral del Cáncer Robert H Lurie. Agradecemos a Sean McDermott por su asistencia técnica y apoyo, y maya Epstein por las ilustraciones dibujadas a mano que se muestran en la Figura 1.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el comité de estudios de animales de la Universidad Northwestern.
1. Preparación previa a cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas
<ol><li>En una campana de cultivo celular rociada con 70% de etanol de antemano, prepare 200 ml de medio de cultivo en un filtro de vacío de 250 ml de botella-tapa unido a un receptor de botella estéril. Añadir 100 ml de águila basal media (BME), 50 ml de solución salina equilibrada de ...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

El cultivo de rodajas cerebelosa es una poderosa herramienta para estudiar la muerte celular programada de Purkinje durante el desarrollo postnatal. Esta técnica se puede utilizar para examinar rápidamente las moléculas candidatas para su potencial neuroprotector. La principal ventaja es que la configuración es simple y muy rentable, y sólo requiere una inversión modesta en equipos (un vibratome puede costar hasta 3 veces más que un helicóptero de tejido). Además, se pueden generar de 10 a 15 rodajas sanas a par...

El modelado in vitro es una herramienta esencial en la investigación biomédica. Permite a los investigadores estudiar y controlar estrechamente mecanismos específicos en tipos de células restringidas, o en sistemas u órganos aislados. El cultivo de rebanadas organotípicas es una técnica in vitro ampliamente utilizada, especialmente en el campo de la neurociencia1. El método fue establecido por primera vez por El sr. G-hwiler, que cultivaba rebanadas cerebrales usando la técnica de tubo de rodillo2,y más tarde modificado por Yamamoto et al., que introdujeron el uso de una membrana microporosa para realizar cultivos de rebanadas corticales3. En comparación con los cultivos celulares primarios, los cultivos de rebanadas organotípicas presentan la ventaja de preservar la citoarquitectura del tejido, así como las conexiones celulares nativas en el plano de la sección del tejido.
Las rebanadas organotípicas se han cultivado desde muchas partes del sistema nervioso central, como el hipocampo4,la corteza5,el estriado6,el cerebelo4,7,y la médula espinal8,9,entre otros. Se ha demostrado que son una herramienta poderosa en los estudios de descubrimiento de fármacos10. Los efectos de las moléculas neuroactivas se pueden evaluar de muchas maneras: supervivencia y neurodegeneración mediante inmunomanchas y ensayos bioquímicos, formación de circuitos neuronales, o interrupción mediante electrofisiología y imágenes en vivo.
El objetivo de este trabajo es describir un método simple para realizar el cultivo organotípico de rodajas cerebelosas, que se sabe que es un modelo relevante para imitar el desarrollo cerebeloso in vitro. Particularmente, nos centramos en el estudio de la muerte del desarrollo celular de Purkinje. In vivo, las células de Purkinje se someten a apoptosis durante la primera semana postnatal, alcanzando su punto máximo en el día postnatal 3 (P3)11. El mismo patrón se observa en el cultivo de rodajas cerebelosas, con las neuronas Purkinje muriendo por apoptosis cuando la cerebella se toma de animales entre P1 y P8, con un pico en P34,12. El uso de los cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas ha permitido identificar varias moléculas neuroprotectoras7,13, así como la comprensión de parte de los mecanismos involucrados en esta muerte celular programada14,15,16. Aquí, describimos un protocolo basado en el estudio de Stoppini et al.17 en el hipocampo, y adaptado al cerebelo por Dusart et al.4 Incluye disección rápida y corte de cerebella postnatal; cultivo de corte en un inserto de cultivo celular que contiene una membrana microporosa, con o sin tratamiento neuroprotector; y la tinción de inmunofluorescencia para evaluar la supervivencia neuronal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

El cultivo de rebanadas organotípicas es un potente modelo in vitro que imita las condiciones in vivo más de cerca que los cultivos celulares primarios disociados. En el desarrollo postnatal temprano, se sabe que las células de Purkinje cerebelosas pasan por un período vulnerable, durante el cual se someten a muerte celular programada. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar la cultura de corte cerebelosa organotípico de ratón durante este momento crítico. Las rodajas se etiquetan además para evaluar la supervivencia celular de Purkinje y la eficacia de los tratamientos neuroprotectores. Este método puede ser extremadamente valioso para detectar nuevas moléculas neuroactivas.

Como se muestra en la Figura 4, este protocolo produce cultivos organotípicos de rodajas cerebelosas en los que se puede evaluar la supervivencia celular de Purkinje siguiendo los pasos de inmunofluorescencia y adquisición de imágenes. Las células purkinje fueron etiquetadas con una combinación de anticuerpos anti-Calbindin D-28K (dilución 1/200) y Alexa594 anti-ratón (dilución 1/300). La costura de imágenes se realizó automáticamente mediante el software de adquisición de micros...

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Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Los cultivos de rodajas organotípicas son una poderosa herramienta para estudiar los procesos neurodesarrollo o degenerativos/regenerativos. Aquí, describimos un protocolo que modela la muerte del neurodesarrollo de las células de Purkinje en cultivos de rebanadas cerebelosas de ratón. Este método puede beneficiar la investigación en el descubrimiento de fármacos neuroprotectores.

Supervivencia de células Purkinje en cultivos de rebanadas de cerebeloso organotípico

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

El cultivo organotípico de la rebanada es una poderosa herramienta para estudiar el neurodesarrollo y los procesos degenerativos o regenerativos. Esta técnica se puede utilizar para examinar rápidamente las moléculas candidatas para su potencial neuroprotector. Este método imita estrechamente las condiciones in vivo, en comparación con los cultivos celulares primarios disociados, ya que la arquitectura del conjunto de tejidos y las conexiones de celdas nativas se conservan dentro de los planos de las secciones.Aquí demostramos el estudio de la muerte celular de Purkinje en el cerebelo en desarrollo. Pero el cultivo de rebanadas organotípicas es igualmente adecuado para modelar enfermedades neurodegenerativas en casi todas las regiones del sistema nervioso central. Demostrando el procedimiento con Jennifer Rakotomamonjy estará Sean McDermott, un técnico de mi laboratorio.Antes de cosechar las rodajas de cerebeloso, en un gabinete de bioseguridad esterilizado, llenar cada pozo de una placa de cultivo de seis pozos con un mililitro de medio de cultivo filtrado al vacío, y añadir el agente farmacológico de interés a los pozos de tratamiento, y un volumen igual de vehículo a los pozos de control. Usando fórceps estériles, coloque un inserto de filtro de membrana PTFE de 0,4 micrómetros en cada pozo, teniendo cuidado de evitar burbujas en la interfaz de cada membrana y el medio, y equilibre el medio en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados y 5% durante dos horas. Para cosechar el cerebelo, utilice fórceps de apósito recto para agarrar la cabeza del cachorro por la nariz, y use tijeras de ojo recto para cortar el cuero cabelludo desde el extremo posterior lateralmente a la línea media.Abra el cráneo de la misma manera, apuntando las puntas de la tijera hacia afuera para evitar dañar el cerebelo, y use una espátula para transferir el cerebro a un plato de 60 milímetros que contenga HBSS frío y cinco miligramos por mililitro de glucosa. Utilice los fórceps de apósito recto para diseccionar cuidadosamente el cerebelo, y utilice fórceps finos curvos estériles para colocar el tejido en un disco de plástico en la mesa de corte de un cortante de tejido. Gire la mesa de corte para orientar el tejido para permitir la adquisición de secciones parasagitales, y tire de la perilla de liberación de la mesa hacia la derecha para mover la mesa de corte hasta que la hoja se coloque en el borde del tejido.A continuación, ajuste el espesor de la rebanada a 350 micrómetros, y la velocidad de la hoja a medio, e inicie el helicóptero. Cuando todo el cerebelo haya sido cortado, apague el helicóptero. Usando fórceps estériles, sostenga el disco sobre un nuevo plato de 60 milímetros.Utilice una pipeta de transferencia para lavar HBSS más glucosa sobre el disco de modo que las rodajas caigan en el plato. Luego, tocando las muestras lo menos posible, usa una microsonda para separar las rebanadas. Utilice la pipeta de transferencia para seleccionar secciones del cerebelo cerca del vermis en inserciones de cultivo celular individuales en la placa de seis pozos, y utilice la microsonda para colocar las rodajas en el centro de cada plaquita.Cuando se hayan colocado todas las rodajas, aspirar cuidadosamente cualquier exceso de HBSS más glucosa, y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular. Para la tinción de inmunofluorescencia, retire el sobrenadante de cada pozo y lave las plaquitas con PBS. Fije las rodajas con un mililitro de frío 4%paraformaldehído en el pozo de cada plaquita, y 500 microlitros encima de cada plaquita durante una hora.Al final de la fijación, lave las plaquitas cuatro veces durante 10 minutos con un mililitro de PBS fresco debajo de cada plaquita y 500 microlitros de PBS fresco en la parte superior de cada inserción por lavado en un agitador orbital. Rellene previamente cada pozo de una placa de 24 pozos con 500 microlitros de PBS-TB, y use un pincel para transferir las rodajas cerebelosas de cada inserto de cultivo celular en pozos individuales de una placa de 24 pozos. Permeabilizar y bloquear las rodajas a temperatura ambiente durante una hora.Al final de la incubación, etiquete las células con 200 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en PBS-TB por pozo durante la noche a cuatro grados celsius en el agitador orbital. A la mañana siguiente, lave las rodajas cuatro veces durante 10 minutos y 500 microlitros de PBS fresco por lavado en la coctelera, antes de etiquetar las muestras con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo apropiados durante dos horas a temperatura ambiente en el agitador, protegidos de la luz. Al final de la incubación, contrate las secciones con 500 microlitros de una mancha nuclear adecuada por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.Y utilice una pipeta de transferencia para montar las rodajas en diapositivas de vidrio. A continuación, deje que las secciones se sequen completamente antes de rehidratarse con PBS y montar los tejidos con cubreobjetos recubiertos con aproximadamente 80 microlitros de medio de montaje. Una vez curado el medio de montaje, las secciones cerebelosas están listas para ser imagen.En el día seis postnatal, la supervivencia de las células de Purkinje es baja en las muestras de control, consistente con su ventana de vulnerabilidad conocida. La supervivencia aumenta a medida que el animal donante envejece y sale de este período crítico. El tratamiento de las rodajas de cerebeloso con una alta concentración de cloruro de potasio resulta en una inducción exitosa de su despolarización y supervivencia.Para obtener resultados consistentes y reproducibles, es fundamental seleccionar secciones cerebelosas saludables y realizar la configuración del cultivo de la manera más eficiente posible. Las aplicaciones post-cultivo van más allá de la inmunofluorescencia. Como se pueden utilizar rebanadas organotípicas para estudios de expresión de proteínas del genoma, y para monitorear la actividad del circuito neuronal utilizando electrofisiología e imágenes vivas de calcio.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicos culturas rebanada hipocampo

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...