Name: purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Imaging arbete utfördes på Northwestern University Center for Advanced Microskopi generöst stöds av NCI CCSG P30 CA060553 tilldelas Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi tackar Sean McDermott för hans tekniska hjälp och stöd, och Maya Epstein för handritade illustrationer visas i figur 1.

Alla experiment med djur utfördes i enlighet med Northwestern University Animal Studies kommittén.
1. beredning före organotypic cerebellär segment kulturer
<ol><li>I en cellkultur huva besprutas med 70% etanol i förväg, förbereda 200 mL odlingssubstrat i en 250 mL flaska-Top vakuum filter bifogas en steril flaska mottagare. Tillsätt 100 ml basal medium Eagle (BME), 50 mL Hanks balanserad saltlösning (HBSS), 50 mL av Värmeinaktiverade häst serum, 1 mL 200 mM L-glutamin (slutlig ko...

<ol>
	<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro.">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li><li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation.">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).</li><li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures,+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson's+disease.">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone+(RU486)+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum.">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li><li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures:+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA(A)+receptors.">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period.">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture:+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis.">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li><li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration.">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li><li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization.">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li><li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+N-terminal+kinase+(JNK)+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture.">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li><li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li><li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain.">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li><li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures.">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).</li><li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin:+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination.">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li><li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li><li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells'+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures.">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li></ol>

Cerebellär slice kultur är ett kraftfullt verktyg för att studera programmerad Purkinje celldöd under postnatal utveckling. Denna teknik kan användas för att snabbt skärmen kandidat molekyler för deras nervskyddande potential. Den största fördelen är att installationen är enkel och mycket kostnadseffektiv, och endast kräver en blygsam investering i utrustning (en vibratome kan kosta upp till 3 gånger mer än en vävnad chopper). Dessutom kan 10 till 15 friska skivor genereras från en mus PUP, vilket möjli...

In vitro-modellering är ett viktigt verktyg i biomedicinsk forskning. Det gör det möjligt för utredare att studera och noggrant kontrollera specifika mekanismer i begränsade celltyper, eller i isolerade system/organ. Organotypic slice kultur är en allmänt använd in vitro-teknik, särskilt inom neurovetenskap1. Metoden fastställdes först av Gähwiler, som odlade hjärn skivor med hjälp av rullrör teknik2, och senare modifierad av Yamamoto et al., som introducerade användningen av en mikroporös membran för att utföra kortikala slice kulturer3. Jämfört med primära cellkulturer, organotypic slice kulturer presentera fördelen av att bevara cytoarchitecture av vävnaden, samt infödda cell-cell-anslutningar i planet av vävnaden avsnitt.
Organotypic skivor har kultiverats från många delar av det centralanervsystemet, såsom Hippocampus4, cortex5, striatum6, lillhjärnan4,7, och ryggmärgen8,9, bland annat. De har visat sig vara ett kraftfullt verktyg i Drug discovery studier10. Effekterna av neuroaktiva molekyler kan bedömas på många sätt: överlevnad och neurodegeneration med hjälp av immunofärgning och biokemi analyser, neuronala krets bildning, eller störningar med hjälp av elektrofysiologi och Live-Imaging.
Målet med detta arbete är att beskriva en enkel metod för att utföra organotypic cerebellär slice kultur, som är kända för att vara en relevant modell för att efterlikna cerebellär utveckling in vitro-. Särskilt fokuserade vi på studiet av Purkinje cell utvecklings död. In vivo, Purkinje celler genomgår apoptos under den första postnatal veckan, topp på postnatal dag 3 (P3)11. Samma mönster observeras i cerebellär slice kultur, med Purkinje nervceller dör av apoptos när cerebella tas från djur mellan P1 och P8, med en topp på P34,12. Användningen av organotypic cerebellär segment kulturer har tillåtit att identifiera flera nervskyddande molekyler7,13, samt förstå en del av de mekanismer som deltar i denna programmerade celldöd14,15,16. Här beskriver vi ett protokoll baserat på studien av stoppini et al.17 i hippocampus, och anpassas till lillhjärnan av Dusart et al.4 det inkluderar snabb dissektion och hackning av postnatal cerebella; skivning kultur på en cellkultur Infoga som innehåller en mikroporösa membran, med eller utan nervskyddande behandling; och immunofluorescenfärgning för att bedöma neuronala överlevnad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium Eagle (BME)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>21010046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet Class II, Type A2</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-540-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-5700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 100X</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9914528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprobes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal laser microscope system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41678-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors, straight</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker Belly Dancer</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>BDRLS0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 24 well</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes, sterile</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>13-711-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures

Organotypic slice kultur är en kraftfull in vitro-modell som mimicks in vivo villkor närmare än dissocierade primära cellkulturer. I tidig postnatal utveckling, cerebellär Purkinje celler är kända för att gå igenom en sårbar period, under vilken de genomgår programmerad celldöd. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att utföra mus organotypic cerebellär slice kultur under denna kritiska tid. Skivorna är ytterligare märkta för att bedöma Purkinje cellöverlevnad och effekten av neuroprotektiva behandlingar. Denna metod kan vara mycket värdefullt att skärmen för nya neuroaktiva molekyler.

Som framgår av figur 4, detta protokoll producerar organotypic cerebellär segment kulturer där Purkinje cellöverlevnad kan bedömas efter immunofluorescens och bild förvärv steg. Purkinje celler var märkta med en kombination av anti-Calbindin D-28K (utspädning 1/200) och Alexa594 anti-mus (utspädning 1/300) antikroppar. Bild sömnad gjordes automatiskt av Mikroskop förvärv programvara (NIS-element) för att få en bild av hela cerebellär slice. Purkinje cell nummer per segment an...

Watch this Scientific Journal Video about Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice kulturer är ett kraftfullt verktyg för att studera neuroutvecklingsrelaterade eller degenerativa/regenerativa processer. Här beskriver vi ett protokoll som modellerar den neuroutvecklande döden av Purkinje celler i mus cerebellär slice kulturer. Denna metod kan gynna forskning inom neuroprotektiva Drug discovery.

Purkinje cell överlevnad i Organotypic cerebellär segment kulturer

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotypisk skiva kultur är ett kraftfullt verktyg för att studera neurodevelopmental och degenerativa eller regenerativa processer. Denna teknik kan användas för att snabbt skärmen kandidat molekyler för deras neuroprotektiva potential. Denna metod härmar nära in vivo villkor, jämfört med dissociated primära cellkulturer, som vävnaden som arkitektur och inhemska cell-cell anslutningar bevaras inom planen i avsnitten.Här visar vi studiet av Purkinje celldöd i utvecklande lillhjärnan. Men organotypisk skiva kultur är lika lämplig att modellera neurodegenerativa sjukdomar i nästan alla centrala nervsystemet region. Demonstrera förfarandet med Jennifer Rakotomamonjy kommer att Sean McDermott, en tekniker från mitt laboratorium.Innan du skördar cerebellarskivorna, i ett steriliserat biosäkerhetsskåp, fyller du varje brunn av en sex-brunnskulturplatta med en milliliter vakuumfiltrerat odlingsmedium och tillsätt det farmakologiska medlet av intresse för behandlingsbanorna, och en lika stor fordonsvolym till kontrollbanorna. Med hjälp av sterila tänjningar, placera en 0,4-mikrometer porstorlek PTFE membranfilter insats i varje brunn, var noga med att undvika bubblor vid gränssnittet för varje membran och mediet, och jämvikt mediet i en 37 grader Celsius och 5%koldioxid inkubator i två timmar. För att skörda lillhjärnan, använd raka förbandstånger för att fatta tag i valphuvudet vid näsan, och använd rak ögonsax för att skära upp hårbotten från den bakre änden i laterled till mittlinjen.Skär upp skallen på samma sätt, pekar saxspetsarna utåt för att undvika att skada lillhjärnan, och använd en spatel för att överföra hjärnan till en 60-millimeters maträtt som innehåller kall HBSS och fem milligram per milliliter glukos. Använd den raka dressing forceps att noggrant dissekera ut lillhjärnan, och använda sterila böjda fina tång för att placera vävnaden på en plastskiva på skärbordet av en vävnadshacka. Rotera skärbordet för att orientera vävnaden så att förvärvet av parasagittal sektioner, och dra bordet release ratten till höger för att flytta skärbordet tills bladet är placerad vid kanten av vävnaden.Justera sedan skiva tjockleken till 350 mikrometer, och bladet hastighet till medium, och starta chopper. När hela lillhjärnan har skivats, stäng av helikoptern. Med hjälp av sterila tämpningar håller du skivan över en ny 60-millimeters skål.Använd en överföringspipett för att spola HBSS plus glukos över skivan så att skivorna faller ner i skålen. Sedan, röra vid proverna så minimalt som möjligt, använd en mikrosond för att separera skivorna. Använd överföringspipetten för att välja sektioner av lillhjärnan nära vermis på enskilda cellodlingsinsatser i sex-brunnsplattan och använd mikrosonden för att placera skivorna i mitten av varje skär.När alla skivor har placerats, försiktigt aspirera eventuella överskott HBSS plus glukos, och returnera plattan till cellodling inkubatorn. För immunofluorescensfärgning, ta bort supernatanten från varje brunn, och tvätta inläggen med PBS. Fixera skivorna med en milliliter kall 4%paraformaldehyd i brunnen i varje skär, och 500 mikroliter ovanpå varje skär i en timme.Vid slutet av fixeringen tvättar du inläggen fyra gånger i 10 minuter med en milliliter färsk PBS under varje insats och 500 mikroliter färska PBS ovanpå varje insats per tvätt på en orbitalskakare. Förfyll varje brunn av en 24-brunnsplatta med 500 mikroliter PBS-TB och använd en pensel för att överföra cerebellarskivorna från varje cellodlingsinsats i enskilda brunnar av en 24-brunnsplatta. Genomsyra och blockera skivorna i rumstemperatur i en timme.I slutet av inkubationen, märka cellerna med 200 mikroliter av den primära antikropp av intresse utspädd i PBS-TB per brunn över natten vid fyra grader Celsius på omloppsbanor shaker. Nästa morgon, tvätta skivorna fyra gånger i 10 minuter och 500 mikroliter färska PBS per tvätt på shaker, innan märkning av proverna med lämpliga fluorofore-konjugerade sekundära antikroppar i två timmar vid rumstemperatur på shaker, skyddad från ljus. I slutet av inkubationen, räknaren bese sektionerna med 500 mikroliter av en lämplig nukleär fläck per brunn i 10 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus.Och använd en överföringspipett för att montera skivorna på glasrutschbanor. Låt sedan sektionerna lufttorka helt innan de rehydrerar med PBS och monterar vävnaderna med täcken belagda med cirka 80 mikroliter av monteringsmedium. När monteringsmediet har härdat är cerebellarsektionerna redo att avbildas.Vid postnatal dag sex är Purkinje-cellens överlevnad låg i kontrollproverna, vilket överensstämmer med deras kända sårbarhetsfönster. Överlevnaden ökar när donatordjuret blir äldre och lämnar denna kritiska period. Behandlingen av cerebellar skivor med en hög koncentration av kaliumklorid resulterar i framgångsrik induktion av deras depolarisering och överlevnad.För att erhålla konsekventa och reproducerbara resultat är det avgörande att välja friska cerebellarsektioner, och att utföra kulturinställningen så effektivt som möjligt. Applikationer efter kultur går utöver immunofluorescens. Som organotypiska skivor kan användas för genomproteinuttryck studier, och för övervakning av neuronal krets aktivitet med hjälp av elektrofysiologi och kalcium levande avbildning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypic Slice Kultur av GFP-uttryckande musembryon i realtid avbildning av perifera nerver utväxt

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampus Slice kulturer

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic Cerebellar kulturer: apoptotiska utmaningar och Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-inbäddade immunoguld Märkning av Synaptic proteiner i hippocampus slice kulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic Slice kulturer för att studera Oligodendrocyte Dynamics och myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Den Analys av neurovaskulär Remodeling i Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Selektiv Utarmning av mikroglia från Cerebellar Granule cellkulturer Använda L-leucinmetylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...