Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin at JoVE.com

Ondersteuning voor deze studie kwam van het veld Neurosciences Institute op Ascension of St. Mary's.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité (ACUC) van de Saginaw Valley State University. Het menselijk weefsel werd verkregen van een gevestigde hersen Bank aan het banner Sun Health Institute in Arizona15,16.
1. perfusie van de dieren
<ol><li>Bereid de fixeer-en perfusie buffers voor.<ol>
<li>Bereid 0,1 M natriumfosfaat buffer door toevoeging van 80 g natriumchloride (NaCl), 2 g kaliumchl...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Curcumin,+a+Natural+Polyphenol+for+Targeting+Molecular+Pathways+in+Treating+Age-Related+Neurodegenerative+Diseases.">Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+curcumin+forms+selectively+bind+fibrillar+amyloid+beta+in+post+mortem+Alzheimer's+disease+brains:+Implications+for+in-vivo+diagnostics.">Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).</li><li>Koronyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+amyloid+pathology+and+proof-of-concept+imaging+trial+in+Alzheimer's+disease.">Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease.</a> JCI Insight. 2 (16), (2017).</li><li>Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subregions+of+the+inferior+parietal+lobule+are+affected+in+the+progression+to+AD.">Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD.</a> Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).</li><li>Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+has+potent+anti-amyloidogenic+effects+for+Alzheimer's+beta-amyloid+fibrils+in+vitro.">Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro.</a> Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).</li><li>Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+labels+amyloid+pathology+in+vivo,+disrupts+existing+plaques,+and+partially+restores+distorted+neurites+in+an+Alzheimer+mouse+model.">Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model.</a> Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).</li><li>Mutsuga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+curcumin+to+senile+plaques+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+the+aged+brain+of+various+animals+and+to+neurofibrillary+tangles+in+Alzheimer's+brain.">Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).</li><li>Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

Onze hypothese was dat cur zou kunnen worden gebruikt als de snelste, eenvoudigste en minst dure manier om Aβ-plaques in het postmortemad hersenweefsel te labelen en te afbeeldenten in vergelijking met andere klassieke amyloïde bindende kleurstoffen, evenals Aβ-specifieke antilichamen. De doelstellingen van deze studie waren het bepalen van de minimumtijd die nodig is om Aβ-plaques te labelen en te afbeelden door cur in het postmortemad hersenweefsel en te bepalen of cur kan worden gebruikt als alternatief voor Aβ-a...

De ziekte van Alzheimer (AD) is een van de meest voorkomende, leeftijdsgebonden, progressieve neurologische aandoeningen en een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd1,2. Leren, geheugen en cognitie stoornissen, samen met neuropsychiatrische stoornissen, zijn de veelvoorkomende symptomen die zich manifesteren in AD3. Hoewel de etiologie van AD niet volledig is opgehelderd, geeft het beschikbare genetische, biochemische en experimentele bewijs aan dat de geleidelijke afzetting van Aβ een definitieve biomarker voor AD4is. Dit misgevouwen eiwit hoopt zich op in intracellulaire en extracellulaire ruimten en wordt verondersteld te worden betrokken bij synaptische verlies, verhoogde neuro ontsteking, en neurodegeneratie in de corticale en hippocampal regio's in de hersenen beïnvloed door AD5. Daarom is histochemische detectie van Aβ in het AD-weefsel een cruciale eerste stap in het ontwikkelen van niet-toxische, anti-amyloïde geneesmiddelen om de progressie van de advertentie te voorkomen.
In de afgelopen decennia zijn verschillende kleurstoffen en antilichamen door veel onderzoeklaboratoria gebruikt om Aβ-plaques in hersenweefsel te labelen en te afbeelden, maar sommige van deze methoden zijn tijdrovend en de gebruikte kleurstoffen of antilichamen zijn duur, waarvoor meerdere accessoires nodig zijn Chemische stoffen. Daarom zou de ontwikkeling van een goedkope manier van detectie van Aβ-plaques in de AD-hersenen een welkome nieuwe tool zijn. Veel laboratoria begonnen met het gebruik van cur, een veelbelovende anti-amyloïde natuurlijke polyfenol, voor labeling en beeldvorming Aβ, evenals een therapeutische agent voor AD6,7,8,9. De hydrofobiciteit en lypofiele aard, structurele gelijkenissen met klassieke amyloïde bindende kleurstoffen, sterke fluorescentie activiteit, evenals sterke affiniteit om te binden met Aβ maakt het een ideale de voor het labelen en beeldvorming van Aβ-plaques in AD-weefsel10 . Cur bindt met Aβ-plaques en oligomeren en de aanwezigheid ervan wordt ook gedetecteerd in intracellulaire ruimten7,11,12,13. Bovendien is aangetoond dat minimale hoeveelheden (1 − 10 nM) van cur can label Aβ plaques in 5x familiaire ziekte van Alzheimer (5xFAD) hersenweefsel7. Hoewel de concentratie van 1 nM niet de optimale fluorescentie intensiteit biedt voor het tellen van Aβ-plaques, is een concentratie van 10 nM of hoger van cur. Ran en collega's14 rapporteerden dat doses van slechts 0,2 nm van difluorboron-derivatized cur in vivo Aβ-afzettingen kunnen detecteren, evenals een infrarood sonde. Of deze dosis voldoende is om Aβ-plaques in weefsel te labelen, is nog steeds niet duidelijk. De meeste eerdere studies hebben 20 − 30 minuten gebruikt voor het kleuring van Aβ-plaques met behulp van cur, maar optimale kleuring kan veel minder tijd vergen.
De huidige studie werd ontworpen om de minimale tijd die door cur nodig is om Aβ-plaques in AD-hersenweefsel te labelen en om de gevoeligheid voor etikettering en beeldvorming van Aβ-plaques in hersenweefsel van de 5xFAD-muizen te vergelijken na kleuring met cur met andere conventionele Aβ-bindende kleurstoffen, zoals Thioflavine-S (thio-S), Congo rood (CR), en fluoro-Jade C (FJC). Het Aβ-etiketterings vermogen van deze klassieke amyloïde bindings kleurstoffen werd vergeleken met de huidige kleuring in paraffine-ingesloten en cryostaat coronale hersen secties van 5xFAD-muizen en van verouderde menselijke AD-en controle hersenweefsel. De bevindingen suggereren dat de cur-labels Aβ-plaques op een manier die vergelijkbaar is met Aβ-specifieke antilichamen (6E10) en matig beter dan thio-S, CR of FJC. Bovendien, wanneer intraperitoneale injecties van cur tot 5xFAD muizen werden toegediend voor 2 − 5 dagen, het stak de bloed-hersen barrière en gebonden met Aβ plaques7. Interessant is dat de nanomolaire concentraties van cur zijn gebruikt om Aβ-plaques in 5xfad-hersenweefsel7,14te labelen en te afbeelden. Bovendien kunnen morfologisch verschillende Aβ-plaques, zoals kern-, neuritische, diffuse en uitgebrande plaques, door cur efficiënter worden gelabeld dan met een van de andere conventionele amyloïde bindings kleurstoffen7. Overall, cur kan worden toegepast op etiket en beeld Aβ plaques in Postmortem hersenweefsel van AD diermodellen en/of menselijk AD weefsel op een eenvoudige en goedkope manier, als een betrouwbaar alternatief voor Aβ-specifieke antilichamen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

De afzetting van amyloïde bèta-eiwitten (Aβ) in extra-en intracellulaire ruimten is een van de kenmerkende pathologieën van de ziekte van Alzheimer (AD). Daarom is detectie van de aanwezigheid van Aβ in AD hersenweefsel een waardevol hulpmiddel voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen om de progressie van AD te voorkomen. Er zijn verschillende klassieke amyloïde bindende kleurstoffen, fluorochrome, Imaging sondes en Aβ-specifieke antilichamen gebruikt om Aβ histochemisch op te sporen in AD hersenweefsel. Gebruik van deze verbindingen voor Aβ-detectie is kostbaar en tijdrovend. Vanwege zijn intense fluorescentie activiteit, hoge affiniteit en specificiteit voor Aβ, evenals structurele gelijkenissen met traditionele amyloïde bindende kleurstoffen, is curcumine (CUR) een veelbelovende kandidaat voor het labelen en beeldvorming van Aβ-plaques bij postmortem hersenweefsel. Het is een natuurlijke polyfenol van het kruid Curcuma longa. In de huidige studie, cur werd gebruikt om histochemisch label Aβ plaques van zowel een genetische muismodel van 5x familiaire ziekte van Alzheimer (5xFAD) en van menselijke AD weefsel binnen een minuut. Het etiketterings vermogen van cur werd vergeleken met conventionele amyloïde bindende kleurstoffen, zoals thioflavine-S (thio-S), Congo rood (CR) en fluoro-Jade C (FJC), evenals Aβ-specifieke antilichamen (6E10 en A11). We hebben geconstateerd dat cur de meest goedkope en snelste manier is om Aβ-plaques te labelen en te afbeeldenten in vergelijking met deze conventionele kleurstoffen en is vergelijkbaar met Aβ-specifieke antilichamen. Daarnaast bindt cur met de meeste Aβ-soorten, zoals oligomeren en fibrils. Daarom kan cur worden gebruikt als de meest kosteneffectieve, eenvoudige en snelle fluorochrome detectie-agent voor Aβ-plaques.

Curcumine etiketten Aβ plaques binnen een minuut. Wanneer we gekleurd 5xFAD weefsel met cur, we vonden dat cur label Aβ plaques binnen 1 min. Hoewel de toegenomen incubatietijd met de cur de intensiteit van de fluorescentie van Aβ-plaques enigszins verhoogde, was het aantal waargenomen Aβ-plaques niet significant verschillend tussen 1 min en 5 min kleurings tijd (Figuur 1).
Cur kan Aβ-plaques l...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin at JoVE.com

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Curcumine is een ideale de voor het labelen en beeldvorming van amyloïde beta eiwit plaques in hersenweefsel als gevolg van de preferentiële binding aan amyloïde beta-eiwit, alsmede de structurele gelijkenissen met andere traditionele amyloïde bindende kleurstoffen. Het kan worden gebruikt om te labelen en beeld amyloïde beta eiwit plaques efficiënter en goedkoop dan traditionele methoden.

Etikettering en beeldvorming van amyloïde plaques in hersenweefsel met behulp van de natuurlijke Polyphenol curcumine

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Dit protocol is de meest efficiënte en kosteneffectieve methode voor het nauwkeurig labelen van bèta-amyloïde plaques, in vergelijking met amyloïde-specifieke antilichamen, die momenteel de gouden standaard zijn voor het labelen van deze plaques. Deze techniek kost minder tijd en is net zo effectief als een van de veelgebruikte amyloïde etiketteringsmethoden. Curcumine bindt sterk aan amyloïde plaques en kan worden gebruikt als een imaging sonde tijdens PET-scans van de hersenen en voor relatief niet-invasieve screenings met behulp van retinale scanning.Curcumine bindt zich ook aan neurofibrillaire of tau kluwen bij de ziekte van Alzheimer, alfa synuclein bij de ziekte van Parkinson en gemuteerde ZvH eiwitten bij de ZvH. Het aantonen van de procedure met Panchanan Maiti zal Zackary Bowers, een afgestudeerde student, en Alexandra Plemmons, een onderzoeker van mijn lab. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pijnreflex in een verdoofde 12 maanden oude alzheimer model muis, plaats de muis in de supine positie op een operatie lade en maak een incisie in de buik en via het middenrif.Steek een 21-meter perfusienaald in de incisie en maak een kleine incisie aan de rechter oorschelp om de perfusievloeistof uit het lichaam te laten weglopen. Gebruik een zwaartekracht gevoed perfusie systeem om ijskoude 0,1 molaire PBS vloeistof te laten stromen in de naald gedurende vijf tot zes minuten op een 20 tot 25 milliliter per minuut stroomsnelheid. Als de perfusie correct wordt uitgevoerd, wordt een duidelijke lever waargenomen.Een goede dierlijke perfusie is essentieel omdat als het bloed niet volledig wordt verwijderd, curcumine kan binden aan de bloedvaten en resulteren in een groene fluorescerende achtergrond signaal. Wanneer alle PBS is geleverd, schakel de bufferklep op een ijskoude 4%paraformaldehyde oplossing gedurende acht tot 10 minuten voor het gebruik van schaar en tangen om de hersenen te bevrijden van de schedel. Gebruik vervolgens een spatel om de hersenen in een flacon van 4% paraformaldehyde ten minste 10 keer het weefsel volume voor vier graden Celsius opslag tot verwerking.Om secties voor cryostat sectioning te verkrijgen, dompelt u de hersenen achtereenvolgens onder in gesorteerde sacharoseoplossingen bij vier graden Celsius gedurende 24 uur per concentratie voordat u een cryostat gebruikt bij negatieve 22 graden Celsius om 40 micrometersecties te verkrijgen, waarbij 10 tot 20 secties per put worden geplaatst in een zesputken met PBS aangevuld met 0,02%-azide zoals ze worden verkregen. Wanneer alle monsters zijn verworven, bewaar de secties op vier graden Celsius tot verdere verwerking. Om secties voor paraffinesectie te verkrijgen, dehydrateren post-vast geperfundeerd hersenweefsel met sequentiële alcoholoplossingen voor twee uur per concentratie, gevolgd door twee alcoholonderdompeling van een uur 100% en twee xylene-onderdompe onderdompeling van een uur bij kamertemperatuur.Na de laatste xylene onderdompeling, penetreren het weefsel met een een tot een xyleen tot paraffine oplossing twee keer voor een uur per incubatie bij 56 graden Celsius in een glas conische glas bedekt met aluminiumfolie voor het onderdompelen van de weefsels in 56 graden Celsius paraffine voor vier tot zes uur. Gebruik aan het einde van de incubatie een roterende microtome bij kamertemperatuur om vijf micrometer dikke secties te verkrijgen die de secties in een 45 graden Celsius weefselwaterbad plaatsen terwijl ze worden verzameld. Voor curcumine etikettering van amyloïde beta plaques in cryostat weefsel secties, spoel de secties met PBS drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt alvorens de secties in 70% ethanol gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.Terwijl de secties uitbroeden, los een millimolar van voorraad curcumine in methanol en verdun de oplossing tot een uiteindelijke werkconcentratie van 10 micromolar met 70%ethanol. Dompel aan het einde van de incubatie de secties in de werkende curcumineoplossing gedurende 10 minuten onder bij kamertemperatuur bij 50 rotaties per minuut. Gooi aan het einde van de kleuringsperiode de curcumineoplossing weg en was de secties met drie wasbeurten van twee minuten in 70% ethanol.Breng na de laatste wasbeurt de secties over op glasplaten met polylysine bekleed en zet een afdekbrief op elke glijbaan met een geschikt organisch montagemedium. Bekijk vervolgens de secties op een florescentiemicroscoop met behulp van een 10 of 20x doelstelling en de juiste excitatie- en emissiefilters. Voor histochemische etikettering van diepe geparaffeerde weefselsecties, dompel de vijf micrometer dikke secties in xyleen twee keer gedurende vijf minuten onder bij kamertemperatuur per onderdompeling, gevolgd door rehydratie met een graad alcohol oplossing onderdompe onderdompeling.Aan het einde van de incubatie, was de secties met gesorteerde alcohol oplossingen gedurende twee minuten per concentratie, gevolgd door clearing met twee vijf minuten xylene onderdompees. Na de tweede xyleen onderdompeling, monteer elke sectie op een microscoop schuif met een cover slip en een geschikte montage medium voor florescence microscopie imaging zoals aangetoond. Voor het etiketteren van cryostat sectiemonsters met anti-A-bètaantilichamen, was de monsters drie maal met verse PBS per wasbeurt in afzonderlijke putten van een 12 putplaat voordat u een niet-specifieke binding blokkeert met 10% normaal geitenserum in PBS en 0,5% triton x-100 gedurende een uur bij kamertemperatuur.Gooi aan het einde van de incubatie de blokkeringsoplossing weg en ontcubeer de monsters met een bèta-specifiek antilichaam 's nachts bij vier graden Celsius en 150 rotaties per minuut. De volgende ochtend, was de secties met drie 10 minuten wast in verse PBS per wasbeurt, gevolgd door incubatie met een passende secundaire antilichaam geconjugeerd met een rode fluorofophore gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie was je de secties drie keer met PBS, gevolgd door één wasbeurt met 70% alcohol.Na de alcoholwassing, incubeer de secties met 10 micromolar curcumine gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie een minuut 70%alcohol wast. Na de laatste wasbeurt dehydrateren de secties met 90% en 100%alcohol gedurende één minuut per concentratie en maak de secties twee keer gedurende vijf minuten per onderdompeling met verse xyleen per incubatie. Dan monteren en beeld van de secties zoals aangetoond.Voor intracellulaire amyloïde beta co-lokalisatie, vlek de secties met anti amyloïde beta antilichaam gevolgd door vlekken met curcumine bij kamertemperatuur en 50 rotaties per minuut beschermd tegen licht zoals aangetoond. Aan het einde van de incubatie, contrastain met een geschikte nucleaire kleurstof gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 50 rotaties per minuut beschermd tegen licht, gevolgd door drie wasbeurten in PBS. Dan monteren en beeld van de secties door fluorescentie microscopie zoals aangetoond.Hoewel het verhogen van de incubatietijd met curcumine de fluorescentieintensiteit van de A-bètaplaten enigszins verhoogt, is het aantal waargenomen plaques niet significant verschillend tussen één en vijf minuten kleuringstijd. Curcumine kan worden gebruikt om vlekken Een beta plaques en cryosectioned, paraffine ingebed, en de menselijke ziekte van Alzheimer weefsel monsters. Etikettering met een bèta-specifiek antilichaam voor curcumine kleuring blijkt dat de curcumine is volledig co-gelokaliseerd met A beta op dezelfde plaques die het antilichaam binden.Na vlekken met curcumine gelabeld Een beta oligomers, curcumine co-lokalisatie met de oligomers kan worden waargenomen in A beta plaques. Op dezelfde manier co-localiseert curcumine ook met het A-bètaspecifieke antilichaam in intracellulaire ruimten, wat bevestigt dat de vlek intracellulaire A-bèta kan labelen. Curcumine etikettering is ook prominenter dan conventionele amyloïde binding kleurstoffen.Curcumine derivaten gevonden in tumeric extracten label Een bètaplaques relatief tot curcumine in de menselijke ziekte van Alzheimer hersenweefsel, ongeacht het type montage medium gebruikt. Bovendien worden curcumine immunofluorescentiesignalen en contrastainingintensiteit gehandhaafd, zelfs na het bevlekken met typische nucleaire vlekken en andere celmarkers. We hebben ontmoet dat constante secties dunner moeten zijn dan 40 micron.Deze trainingsprocedure moet onder 30 minuten worden gehouden en de optimale curcumineconcentratie is één tot twee micromolar. Dubbele nivellering vertraagde biomarkers kunnen worden uitgevoerd op hetzelfde weefsel en kan een grotere specificiteit van welke soorten hersencellen worden genivelleerd. Gezien het feit dat curcumine de belasting van amyloïde plaque kan verminderen, worden de precieze mechanismen van hoe dit proces plaatsvindt momenteel onderzocht op zowel cellulair als moleculair niveau.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Neuroscience

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxische Infusion van Oligomere amyloid-beta in de Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Correlatieve Licht en Electron Microscopy om te studeren Microgliale Interacties met β-amyloïde plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimatie van DAN Matrix voor de detectie en Visualisatie van gangliosiden in Rat Brain Tissue voor MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging van intracellulaire ATP in Organotypic weefsel segmenten van de muis hersenen met behulp van de FRET-gebaseerde sensor ATeam 1.03Yemk

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...