Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
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Unterstützung für diese Studie kam vom Field Neurosciences Institute at Ascension of St. Mary es.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Saginaw Valley State University genehmigt. Das menschliche Gewebe wurde von einer etablierten Gehirnbank am Banner Sun Health Institute in Arizona15,16gewonnen.
1. Perfusion der Tiere
<ol><li>Bereiten Sie die Fixier- und Perfusionspuffer vor.<ol>
<li>0,1 M Natriumphosphatpuffer vorbereiten, indem 80 g Natriumchlorid (NaCl), 2 g Kaliumchlorid (KCl), 2...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. 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L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. 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K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

Unsere Hypothese war, dass Cur als schnellste, einfachste und kostengünstigste Methode verwendet werden könnte, um A-Plaques im postmortalen AD-Gehirngewebe im Vergleich zu anderen klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen sowie A-spezifischen Antikörpern zu beschriften und abzubilden. Ziel dieser Studie war es, die Mindestzeit für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques durch Cur im postmortalen AD-Gehirngewebe zu bestimmen und zu bestimmen, ob Cur als Alternative zum A-Antikörper zur Kennzeichnung von A-Plaque...

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der häufigsten, altersbedingten, fortschreitenden neurologischen Erkrankungen und eine der häufigsten Todesursachen weltweit1,2. Lern-, Gedächtnis- und Kognitionsstörungen, zusammen mit neuropsychiatrischen Störungen, sind die häufigsten Symptome, die sich in AD3manifestieren. Obwohl die Ätiologie von AD noch nicht vollständig aufgeklärt wurde, deuten die verfügbaren genetischen, biochemischen und experimentellen Beweise darauf hin, dass die allmähliche Ablagerung von Aa ein endgültiger Biomarker für AD4ist. Dieses falsch gefaltete Protein sammelt sich in intrazellulären und extrazellulären Räumen an und wird angenommen, dass es an synaptischen Verlusten, erhöhter Neuroinflammation und Neurodegeneration in den kortikalen und hippocampalen Regionen im Gehirn beteiligt ist, die von AD5betroffen sind. Daher ist der histochemische Nachweis von Aa im AD-Gewebe ein entscheidender erster Schritt bei der Entwicklung ungiftiger Anti-Amyloid-Medikamente zur Verhinderung der AD-Progression.
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Farbstoffe und Antikörper von vielen Forschungslaboratorien verwendet, um A-Plaques im Hirngewebe zu kennzeichnen und abzubilden, aber einige dieser Methoden sind zeitaufwändig und die verwendeten Farbstoffe oder Antikörper sind teuer, was mehrere Zubehörteile erfordert. Chemikalien. Daher wäre die Entwicklung eines kostengünstigen Nachweismittels für A-Plaques im AD-Gehirn ein willkommenes neues Werkzeug. Viele Laboratorien begannen mit Cur, einem vielversprechenden Anti-Amyloid-Naturpolyphenol, für die Kennzeichnung und Bildgebung von A, sowie einem therapeutischen Mittel für AD6,7,8,9. Seine Hydrophobie und lypophile Natur, strukturelle Ähnlichkeiten mit klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffen, starke fluoreszierende Aktivität, sowie eine starke Affinität zur Bindung mit Aa macht es zu einem idealen Fluorophor für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques im AD-Gewebe10 . Cur bindet mit A-Plaques und Oligomeren und seine Anwesenheit wird auch in intrazellulären Räumen7,11,12,13nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass minimale Mengen (1x 10 nM) von Cur A-Plaques bei 5x familiärer Alzheimer-Krankheit (5xFAD) Hirngewebe7beschriften können. Obwohl die 1 nM-Konzentration nicht die optimale Fluoreszenzintensität für die Zählung von A-Plaques liefert, ist eine 10 nM oder höhere Konzentration von Cur nicht. Ran und Kollegen14 berichteten, dass Dosen von bis zu 0,2 nM difluoroboron-derivatisierter Kur in vivo A-Ablagerungen fast so gut wie eine Infrarotsonde erkennen können. Ob diese Dosis ausreicht, um A-Plaques im Gewebe zu kennzeichnen, ist noch unklar. Die meisten früheren Studien haben 20-30 min für die Färbung von A-Plaques mit Cur verwendet, aber eine optimale Färbung kann viel weniger Zeit in Sicherstellung enden.
Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die minimale Zeit zu testen, die Cur benötigt, um A-Plaques im AD-Gehirngewebe zu kennzeichnen und die Empfindlichkeit für die Kennzeichnung und Bildgebung von A-Plaques im Hirngewebe von den 5xFAD-Mäusen nach der Färbung mit Cur mit anderen konventionellen Bindende Farbstoffe wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC). Die A-Etikettierungsfähigkeit dieser klassischen Amyloid-Bindungsfarbstoffe wurde mit Der Färbung in paraffin-eingebetteten und kryostatkoronalen Hirnabschnitten von 5xFAD-Mäusen und aus altersgerechten menschlichen AD und der Kontrolle des Hirngewebes verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cur-Plaques in einer Weise, die A-spezifischen Antikörpern (6E10) und mäßig besser als Thio-S, CR oder FJC ähnelt. Darüber hinaus, wenn intraperitoneale Injektionen von Cur an 5xFAD Mäuse für 2-5 Tage verabreicht wurden, überquerte es die Blut - Hirn-Schranke und gebunden mit A- Plaques7. Interessanterweise wurden nanomolare Konzentrationen von Cur verwendet, um A-Plaques in 5xFAD Hirngewebe7,14zu beschriften und abzubilden. Darüber hinaus können morphologisch unterschiedliche A-Plaques, wie Kern-, neuritische, diffuse und ausgebrannte Plaques, durch Cur effizienter gekennzeichnet werden als bei jedem anderen konventionellen Amyloid-Bindungsfarbstoff7. Insgesamt kann Cur auf die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe aus AD-Tiermodellen und/oder menschlichem AD-Gewebe auf einfache und kostengünstige Weise angewendet werden, als zuverlässige Alternative zu A-spezifischen Antikörpern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

Die Ablagerung von Amyloid-Beta-Proteinen (A) in extra- und intrazellulären Räumen ist eine der charakteristischen Pathologien der Alzheimer-Krankheit (AD). Daher ist der Nachweis des Vorhandenseins von Aa im AD-Gehirngewebe ein wertvolles Werkzeug für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, um das Fortschreiten von AD zu verhindern. Mehrere klassische Amyloid-Bindungsfarbstoffe, Fluorchrom, bildgebende Sonden und A-spezifische Antikörper wurden verwendet, um Aa histochemisch im AD-Gehirngewebe zu detektieren. Die Verwendung dieser Verbindungen für die A-Erkennung ist kostspielig und zeitaufwändig. Aufgrund seiner intensiven fluoreszierenden Aktivität, der hohen Affinität und der Spezifität von Aa sowie struktureller Ähnlichkeiten mit traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen ist Curcumin (Cur) jedoch ein vielversprechender Kandidat für die Kennzeichnung und Abbildung von A-Plaques in postmortem Hirngewebe. Es ist ein natürliches Polyphenol aus dem Kraut Curcuma longa. In der vorliegenden Studie wurde Cur verwendet, um A-Plaques sowohl aus einem genetischen Mausmodell der 5x familiären Alzheimer-Krankheit (5xFAD) als auch aus menschlichem AD-Gewebe innerhalb einer Minute histochemisch zu kennzeichnen. Die Etikettierfähigkeit von Cur wurde mit herkömmlichen Amyloid-Bindungsfarbstoffen wie Thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR) und Fluoro-jade C (FJC) sowie A-spezifischen Antikörpern (6E10 und A11) verglichen. Wir beobachteten, dass Cur der preiswerteste und schnellste Weg ist, A-Plaques im Vergleich zu diesen herkömmlichen Farbstoffen zu beschriften und abzubilden und mit A-spezifischen Antikörpern vergleichbar ist. Darüber hinaus bindet Cur mit den meisten A-Arten, wie Oligomere und Fibrillen. Daher könnte Cur als kostengünstigstes, einfachstes und schnellstes Fluorchrom-Detektionsmittel für A-Plaques verwendet werden.

Curcumin beschriftet A-Plaques innerhalb einer Minute. Als wir 5xFAD Gewebe mit Cur färbten, fanden wir, dass Cur-Label A-Plaques innerhalb von 1 min. Obwohl die erhöhte Inkubationszeit mit Cur die Fluoreszenzintensität von A-Plaques leicht erhöhte, war die Anzahl der beobachteten A-Plaques zwischen 1 min und 5 min Färbungszeit nicht signifikant unterschiedlich (Abbildung 1).
Cur kann A-Plaques...

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Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Curcumin ist ein ideales Fluorophor für die Kennzeichnung und Bildgebung von Amyloid-Beta-Protein-Plaques im Gehirngewebe aufgrund seiner bevorzugten Bindung an Amyloid-Beta-Protein sowie seiner strukturellen Ähnlichkeiten mit anderen traditionellen Amyloid-Bindungsfarbstoffen. Es kann verwendet werden, um Amyloid-Beta-Protein-Plaques effizienter und kostengünstiger als herkömmliche Methoden zu beschriften und abzubilden.

Etikettierung und Bildgebung von Amyloid-Plaques im Gehirngewebe mit dem natürlichen Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Dieses Protokoll ist die effizienteste und kostengünstigste Methode zur genauen Kennzeichnung von Beta-Amyloid-Plaques im Vergleich zu Amyloid-spezifischen Antikörpern, die derzeit der Goldstandard für die Kennzeichnung dieser Plaques sind. Diese Technik nimmt weniger Zeit in Anspruch und ist genauso effektiv wie jede der häufig verwendeten Amyloid-Etikettierungsmethoden. Curcumin bindet stark an Amyloid-Plaques und kann als bildgebende Sonde während PET-Scans des Gehirns und für relativ nichtinvasive Screenings mit Netzhautscanning verwendet werden.Curcumin bindet auch an neurofibrilläres oder Tau-Wirrwarr bei der Alzheimer-Krankheit, Alpha-Synuclein bei Parkinson und mutierte Huntington-Proteine bei der Huntington-Krankheit. Das Verfahren mit Panchanan Maiti demonstrieren Zackary Bowers, ein Student, und Alexandra Plemmons, eine Forscherin aus meinem Labor. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Schmerzreflex in einer anästhesierten 12 Monate alten Alzheimer-Krankheit Modell Maus, legen Sie die Maus in die Rückenposition auf einem Operationstablett und machen einen Schnitt in den Bauch und durch das Zwerchfell.Setzen Sie eine 21 Gauge Perfusionsnadel in den Schnitt ein und machen Sie einen kleinen Schnitt an der rechten Ohrmuschel, damit die Perfusionsflüssigkeit aus dem Körper abfließen kann. Verwenden Sie ein schwerkraftgespeistes Perfusionssystem, um eiskalte 0,1 molige PBS-Flüssigkeit fünf bis sechs Minuten lang bei einem Durchfluss von 20 bis 25 Millilitern pro Minute in die Nadel fließen zu lassen. Wenn die Perfusion korrekt durchgeführt wird, wird eine klare Leber beobachtet.Eine richtige tierische Perfusion ist wichtig, denn wenn das Blut nicht vollständig entfernt wird, kann Curcumin an die Blutgefäße binden und zu einem grünen fluoreszierenden Hintergrundsignal führen. Wenn alle PBS geliefert wurden, schalten Sie das Pufferventil für acht bis zehn Minuten auf eine eiskalte 4%Paraformaldehyd-Lösung um, bevor Sie Schere und Zange verwenden, um das Gehirn vom Schädel zu befreien. Dann verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn in eine Durchstechflasche mit 4% Paraformaldehyd mindestens 10 Mal das Gewebevolumen für vier Grad Celsius Lagerung bis zur Verarbeitung zu platzieren.Um Abschnitte für Kryostatschnitte zu erhalten, tauchen Sie das Gehirn sequenziell in abgestufte Saccharoselösungen bei vier Grad Celsius für 24 Stunden pro Konzentration ein, bevor Sie einen Kryostat bei negativen 22 Grad Celsius verwenden, um 40 Mikrometerabschnitte zu erhalten, wobei 10 bis 20 Abschnitte pro Brunnen in eine sechs Bohrplatte mit PBS-Zusatz von 0,02 % Azid platziert werden, die sie erhalten. Wenn alle Proben erworben sind, lagern Sie die Abschnitte bei vier Grad Celsius bis zur WeiterenVerarbeitung. Um Abschnitte für Paraffinschnitt ehydrieren, dehydrieren Sie postfixiertes perfundiertes Hirngewebe mit sequenziellen gestuften Alkohollösungen für zwei Stunden pro Konzentration, gefolgt von zwei einstündigen 100%-Alkohol-Eintauchen und zwei einstündigen Xylol-Eintauchen bei Raumtemperatur.Nach dem letzten Xylol-Eintauchen das Gewebe mit einem Eins-zu-Eins-Xylol-Paraffinlösung zweimal für eine Stunde pro Inkubation bei 56 Grad Celsius in einem mit Aluminiumfolie bedeckten Glas einzutauchen, bevor das Gewebe vier bis sechs Stunden in 56 Grad Celsius Paraffin getaucht wird. Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein rotierendes Mikrotome bei Raumtemperatur, um fünf Mikrometer dicke Abschnitte zu erhalten, die die Abschnitte in ein 45 Grad Celsius-Gewebewasserbad legen, während sie gesammelt werden. Für die Curcumin-Kennzeichnung von Amyloid-Beta-Plaques in Kryostatgewebeabschnitten spülen Sie die Abschnitte mit PBS dreimal für fünf Minuten pro Wäsche ab, bevor Sie die Abschnitte zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 70% Ethanol eintauchen.Während die Abschnitte inkubieren, lösen Sie ein Millimolar von LagerCurcumin in Methanol auf und verdünnen Sie die Lösung auf eine Endarbeitskonzentration von 10 Mikromolaren mit 70% Ethanol. Am Ende der Inkubation tauchen Sie die Abschnitte in die arbeitende Curcumin-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur bei 50 Umdrehungen pro Minute ein. Am Ende der Färbezeit die Curcumin-Lösung entsorgen und die Abschnitte mit drei zweiminütigen Wäschen in 70% Ethanol waschen.Nach der letzten Wäsche die Abschnitte auf polylysinbeschichtete Glasschlitten übertragen und einen Deckelschlupf mit einem geeigneten organischen Montagemedium auf jeden Schlitten montieren. Dann sehen Sie sich die Abschnitte auf einem Blütenstandmikroskop mit einem 10- oder 20-fachen Objektiv und den entsprechenden Anregungs- und Emissionsfiltern an. Für die histochemische Etikettierung von tiefen paraffinierten Gewebeabschnitten tauchen Sie die fünf Mikrometer dicken Abschnitte zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur pro Eintauchen in Xylol ein, gefolgt von einer Rehydratation mit abgestuften einminütigen Eintauchen in Alkohollösung.Am Ende der Inkubation die Abschnitte mit abgestuften Alkohollösungen für zwei Minuten pro Konzentration waschen, gefolgt von einer Lichtung mit zwei fünfminütigen Xylol-Eintauchen. Nach dem zweiten Xylol-Eintauchen, montieren Sie jeden Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten mit einem Deckschlitten und einem geeigneten Montagemedium für die Floreszenzmikroskopie-Bildgebung, wie gezeigt. Zur Kennzeichnung von Kryostatabschnittsproben mit Anti-A-Beta-Antikörpern die Proben dreimal mit frischen PBS pro Waschgang in einzelnen Brunnen einer 12-Well-Platte waschen, bevor Sie eine unspezifische Bindung mit 10% normalem Ziegenserum in PBS und 0,5%Triton x-100 für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren.Entsorgen Sie am Ende der Inkubation die Blockierlösung und inkubieren Sie die Proben mit einem betaspezifischen Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Morgen die Abschnitte mit drei 10-minuten-Waschungen in frischem PBS pro Waschgang waschen, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten Sekundärantikörper, der mit einem roten Fluorophor konjugiert ist, für eine Stunde bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt ist. Am Ende der Inkubation die Abschnitte dreimal mit PBS waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 70% Alkohol.Nach dem Alkoholwaschen die Abschnitte mit 10 Mikromolar Curcumin für 10 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, gefolgt von drei einminütigen 70%Alkoholwäsche. Nach der letzten Wäsche die Abschnitte mit 90% und 100% Alkohol für eine Minute pro Konzentration dehydrieren und die Abschnitte zweimal für fünf Minuten pro Eintauchen mit frischem Xylol pro Inkubation löschen. Montieren und bebilden Sie dann die Abschnitte, wie gezeigt.Für intrazelluläre Amyloid-Co-Lokalisierung, färben Sie die Abschnitte mit Anti-Amyloid-Beta-Antikörper gefolgt von Färbung mit Curcumin bei Raumtemperatur und 50 Rotationen pro Minute vor Licht geschützt, wie gezeigt. Am Ende der Inkubation mit einem geeigneten Kernfarbstoff für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 50 Umdrehungen pro Minute vor Licht geschützt, gefolgt von drei Waschungen in PBS. Dann montieren und abbilden Sie die Abschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie, wie gezeigt.Obwohl die Erhöhung der Inkubationszeit mit Curcumin die Fluoreszenzintensität der A-Beta-Plaques leicht erhöht, unterscheidet sich die Anzahl der beobachteten Plaques zwischen einer und fünf Minuten Färbungszeit nicht signifikant. Curcumin kann verwendet werden, um A Beta-Plaques und kryosectioned, Paraffin eingebettet, und menschliche Alzheimer-Krankheit Gewebeproben zu färben. Die Etikettierung mit einem betaspezifischen Antikörper vor der Curcuminfärbung zeigt, dass das Curcumin vollständig mit A beta an den gleichen Plaques kolokalisiert ist, die den Antikörper binden.Nach der Färbung mit Curcumin mit der Bezeichnung A Beta-Oligomere kann Curcumin-Co-Lokalisierung mit den Oligomeren in A-Beta-Plaques beobachtet werden. In ähnlicher Weise lokalisiert Curcumin auch mit dem A beta-spezifischen Antikörper in intrazellulären Räumen, was bestätigt, dass der Fleck intrazelluläre A-Beta kennzeichnen kann. Curcumin-Etikettierung ist auch prominenter als herkömmliche Amyloid-Bindungfarbstoffe.Curcumin-Derivate in tumerischen Extrakten Gefunden Label A Beta-Plaques vergleichsweise Curcumin in menschlichen Alzheimer-Krankheit Gehirngewebe unabhängig von der Art der Montagemedium verwendet. Darüber hinaus werden Curcumin-Immunfluoreszenzsignale und Gegenfärbungsintensität auch nach der Färbung mit typischen kerntechnischen Flecken und anderen Zellmarkern beibehalten. Wir trafen, dass konstante Abschnitte dünner als 40 Mikrometer sein sollten.Dieses Training sollte unter 30 Minuten gehalten werden und die optimale Curcumin-Konzentration ist ein bis zwei Mikromolar. Doppelte Nivellierung verzögertbiomarker können auf dem gleichen Gewebe durchgeführt werden und können eine größere Spezifität bieten, welche Arten von Gehirnzellen nivelliert werden. Angesichts der Tatsache, dass Curcumin die Amyloid-Plaque-Last reduzieren kann, werden die genauen Mechanismen, wie dieser Prozess abläuft, derzeit sowohl auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene untersucht.

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