Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin at JoVE.com

התמיכה עבור מחקר זה הגיע מן המכון למדעי השדה בהתעלות של מריה הקדושה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (ACUC) של אוניברסיטת סאטינואו וואלי סטייט. רקמת האדם הושגה מבנק המוח הוקמה במכון הבריאות של השמש באנר באריזונה15,16.
1. פרזיה של בעלי החיים
<ol><li>הכן את מאגרי התיקונים והפרזיה.<ol>
<...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Curcumin,+a+Natural+Polyphenol+for+Targeting+Molecular+Pathways+in+Treating+Age-Related+Neurodegenerative+Diseases.">Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+curcumin+forms+selectively+bind+fibrillar+amyloid+beta+in+post+mortem+Alzheimer's+disease+brains:+Implications+for+in-vivo+diagnostics.">Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).</li><li>Koronyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+amyloid+pathology+and+proof-of-concept+imaging+trial+in+Alzheimer's+disease.">Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease.</a> JCI Insight. 2 (16), (2017).</li><li>Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subregions+of+the+inferior+parietal+lobule+are+affected+in+the+progression+to+AD.">Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD.</a> Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).</li><li>Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+has+potent+anti-amyloidogenic+effects+for+Alzheimer's+beta-amyloid+fibrils+in+vitro.">Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro.</a> Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).</li><li>Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+labels+amyloid+pathology+in+vivo,+disrupts+existing+plaques,+and+partially+restores+distorted+neurites+in+an+Alzheimer+mouse+model.">Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model.</a> Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).</li><li>Mutsuga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+curcumin+to+senile+plaques+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+the+aged+brain+of+various+animals+and+to+neurofibrillary+tangles+in+Alzheimer's+brain.">Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).</li><li>Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

ההשערה שלנו הייתה כי הנוכחי יכול לשמש כדרך המהירה, הקלה ביותר, והזולה ביותר לתווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח הנתיחה לאחר המוות בהשוואה לצבעים אחרים של האיגוד עמילואיד, כמו גם נוגדנים ספציפיים Aβ. מטרות מחקר זה היו כדי לקבוע את הזמן המינימלי הנדרש תווית ותמונה לוחיות Aβ ידי Cur בנתיחה לאחר המו?...

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת הנפוצות ביותר, הקשורות לגיל, הפרעות נוירולוגיות מתקדמת ואחד הגורמים המובילים של המוות ברחבי העולם1,2. למידה, זיכרון וליקויי קוגניציה, יחד עם הפרעות נפשיות, הן התסמינים השכיחים הנראים לספירה3. למרות האטיולוגיה של AD לא היה מובהר לחלוטין, הראיות הגנטיות, הביוכימי, וניסיוני מציין כי ההצהרה הדרגתית של Aβ הוא ביוארקר מוחלט עבור AD4. חלבון זה מקופל מצטבר בחללים תאיים ומחלוניים והוא נחשב להיות מעורב באובדן סינפטית, מוגברת דלקת נוירו, ו ניוון נוירוטיות באזורי היפוקמאל במוח המושפע על ידי AD5. לכן, גילוי היסטכימיות של Aβ ברקמת AD הוא צעד ראשון מכריע בפיתוח לא רעילים, תרופות נגד עמילואיד כדי למנוע התקדמות AD.
במהלך העשורים האחרונים, מספר צבעים ונוגדנים שימשו על ידי מעבדות מחקר רבות כדי תווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח, אבל כמה שיטות אלה הם זמן רב, צבע או נוגדנים בשימוש הם יקרים, הדורשים מספר אביזר כימיקלים. לכן, פיתוח של אמצעי זול לגילוי של שלטי Aβ במוח המודעה יהיה כלי מבורך חדש. מעבדות רבות החלו להשתמש Cur, מבטיח אנטי עמילואיד טבעי polyphenol, עבור תיוג והדמיה Aβ, כמו גם סוכן טיפולי עבור AD6,7,8,9. ההידרופוטוליטי והטבע הלינופילית, קווי דמיון מבניים עם צבעי עמילואיד קלאסיים, פעילות פלורסנט חזקה, כמו גם זיקה חזקה לאגד עם Aβ עושה את זה במיוחד fluorophore לתיוג והדמיה של שלטי Aβ ברקמת לספירה10 . נוכחי נקשר עם Aβ-לוחות oligomers ונוכחותו מזוהה גם בחללים תאיים7,11,12,13. בנוסף, זה הוכח כי כמויות מינימליות (1-10 ננומטר) של נוכחי יכול לסמן Aβ שלטים במחלת אלצהיימר משפחתית 5x (5Xתחביב) רקמת המוח7. למרות הריכוזיות 1 ננומטר אינו מספק את עוצמת הקרינה האופטימלית לספירת שלטים Aβ, 10 ננומטר או ריכוז גבוה יותר של נוכחי עושה. רן ועמיתיו14 דיווחו כי מינונים נמוכים כמו 0.2 ננומטר של difluoroboron-לעבוד על הvivo Aβ פיקדונות כמעט כמו גם בדיקה אינפרא אדום. אם מינון זה מספיק כדי תווית Aβ שלטים ברקמה עדיין לא ברור. רוב המחקרים הקודמים השתמשו 20-30 דקות לצביעת לוחיות Aβ באמצעות Cur, אך כתמים אופטימליים עשוי לדרוש הרבה פחות זמן.
המחקר הנוכחי תוכנן כדי לבדוק את הזמן המינימלי הנדרש על ידי Cur כדי תווית Aβ פלאק ברקמת המוח לספירה וכלה להשוות את הרגישות לתיוג והדמיה של שלטי Aβ ברקמת המוח של העכברים 5xFAD לאחר הצביעת עם נוכחי עם קונבנציונאלי אחרים Aβ-כריכת צבעים, כגון Thioflavin-S (Thio-S), קונגו האדום (CR), ו פלואורו-ג'ייד C (FJC). היכולת תיוג Aβ של אלה הצבעים הקלאסיים עמילואיד מחייב הושווה עם כתמים נוכחי ב פרפין-מוטבע וקריוסטט מקטעים המוח ילתית מן העכברים 5xfad מן הבוגרת התואמת האדם לספירה ושליטה רקמת המוח. הממצאים מראים כי תוויות Cur שלטים Aβ באופן דומה לנוגדנים ספציפיים Aβ (6E10) בינוני טוב יותר מאשר Thio-S, CR, או FJC. בנוסף, כאשר זריקות הצפק של Cur לעכברים 5xFAD היו מנוהלים עבור 2-5 ימים, זה חצה את מחסום הדם-מוח מאוגד עם שלטים Aβ7. מעניין, ריכוזי nanomolar של נוכחי שימשו תוויות ותמונה Aβ פלאק ברקמת מוח 5xfad7,14. יתר על כן, שלטים מורפולוגית ברורים Aβ, כגון הליבה, neuritic, לפזר, ונשרף-out שלטים ניתן לתייג על ידי נוכחי ביעילות יותר מאשר עם כל אחד האחרים מאגד עמילואיד בעלי צבע7. בסך הכל, הנוכחי יכול להיות מוחל על תווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח לאחר המוות של AD מודלים בעלי חיים ו/או רקמת AD האדם בצורה קלה וזולה, כחלופה אמינה לנוגדנים ספציפיים Aβ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

התצהיר של חלבון בטא עמילואיד (Aβ) בחללים נוספים ו תאיים הוא אחד הפתווגיות בעלי ההיכר של מחלת אלצהיימר (AD). לכן, זיהוי נוכחות של Aβ ברקמת המוח לספירה הוא כלי רב ערך לפיתוח טיפולים חדשים כדי למנוע את ההתקדמות של AD. מספר כריכת עמילואיד הקלאסי, fluorochrome, הדמיה בדיקה, ו נוגדנים ספציפיים Aβ שימשו כדי לזהות היסטלוכימית Aβ ברקמת המוח לספירה. השימוש תרכובות אלה עבור זיהוי Aβ הוא יקר זמן רב. עם זאת, בגלל פעילות פלורסנט אינטנסיבי שלה, אהדה גבוהה, וספציפיות עבור Aβ, כמו גם קווי דמיון מבניים עם כריכת עמילואיד מסורתיים הצבעים, כורכומין (Cur) הוא מועמד מבטיח תיוג והדמיה של שלטי Aβ בנתיחה שלאחר המוות . רקמת מוח זה פוליפנול טבעי מן העשב Curcuma longa. במחקר הנוכחי, שימש נוכחי תווית היסטAβ לוחיות שלטים ממודל העכבר הגנטי של מחלת אלצהיימר 5x משפחתית (5Xאופנה) ומרקמת האדם האנושי בתוך דקה. יכולת התיוג של נוכחי הושווה לצבעי עמילואיד קונבנציונליים, כגון thioflavin-S (Thio-S), קונגו האדום (CR), ו פלואורו-ג'ייד C (FJC), כמו גם נוגדנים ספציפיים Aβ (6E10 ו A11). הבחנו כי הנוכחי הוא הדרך הזולה ביותר והמהירה ביותר כדי לתייג ולצלם את הפלאק Aβ בהשוואה לצבעים אלה קונבנציונאלי והוא דומה לנוגדנים ספציפיים Aβ. בנוסף, הוא נקשר עם רוב המינים Aβ, כגון oligomers ו fibrils. לכן, הנוכחי יכול לשמש כסוכן החסכוני ביותר, פשוט, ומהיר fluorochrome לזיהוי עבור הפלאק Aβ.

מדבקות כורכומין Aβ שלטים בתוך דקה. כאשר אנו מוכתם רקמות 5xFAD עם Cur, מצאנו כי התווית הנוכחי Aβ לוחיות בתוך 1 דקות. למרות זמן הדגירה המוגבר עם Cur מעט הגדילה את עוצמת הקרינה של הפלאק Aβ, מספר שלטים שנצפו Aβ לא היה שונה באופן משמעותי בין 1 דקות ו 5 דקות מכתים זמן (איור 1)...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin at JoVE.com

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin (Video) | JoVE

כורכומין הוא fluorophore האידיאלי עבור תיוג והדמיה של שלטי החלבון ביתא עמילואיד ברקמת המוח בשל הכריכה המועלת שלה לחלבון ביתא עמילואיד, כמו גם הדמיון המבני שלה עם אחרים מאגד עמילואיד מסורתי צבעים. זה יכול לשמש התווית ביתא עמילואיד התמונה לוחיות החלבון ביעילות רבה יותר מאשר שיטות מסורתיות.

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

פרוטוקול זה הוא השיטה היעילה והחסכונית ביותר לתיוג מדויק של לוחות בטא עמילואיד, בהשוואה לנוגדנים ספציפיים לאמילואיד, שהם כיום תקן הזהב לתיוג לוחות אלה. טכניקה זו לוקחת פחות זמן והיא יעילה באותה מידה כמו כל אחת משיטות תיוג עמילואיד הנפוצות. כורכומין נקשר בחוזקה ללוחות עמילואיד והוא יכול לשמש כגשוש הדמיה במהלך סריקות PET של המוח להקרנות פולשניות יחסית באמצעות סריקת רשתית.כורכומין נקשר גם לסבך נוירופיברילי או טאו במחלת אלצהיימר, אלפא סינוקליין במחלת פרקינסון, וחלבונים מוטנטים של הנטינגטון במחלת הנטינגטון. הדגמת ההליך עם Panchanan Maiti יהיה זאקרי באוורס, סטודנט לתואר שני, ואלכסנדרה פלמונס, מדען מחקר מהמעבדה שלי. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס כאב בעכבר מודל מחלת אלצהיימר בן 12 חודשים, מניחים את העכבר בתמורת סופין על מגש ניתוח ולעשות חתך לתוך הבטן ודרך הסרעפת.הכנס מחט זלולה 21 מד לתוך החתך ולעשות חתך קטן על auricle הימנית כדי לאפשר לנוזל זלולה לנקז מהגוף. השתמש במערכת זלוש כבידה המוזנים כדי לאפשר קר כקרח 0.1 נוזל PBS טוחן לזרום לתוך המחט במשך חמש עד שש דקות בקצב זרימה של 20 עד 25 מיליליטר לדקה. אם תדלוק מבוצע כראוי, כבד ברור יצפה.חיסון נכון של בעלי חיים הוא חיוני כי אם הדם לא יוסר לחלוטין, כורכומין עלול להיקשר לכלי הדם וכתוצאה מכך אות רקע פלואורסצנטי ירוק. כאשר כל PBS נמסר, להעביר את שסתום החיץ לתספורת קר כקרח 4% paraformaldehyde במשך שמונה עד 10 דקות לפני השימוש מספריים ומדפים כדי לשחרר את המוח מהגולגולת. לאחר מכן השתמשו במתית כדי למקם את המוח בבקבוקון של 4% paraformaldehyde לפחות פי 10 מנפח הרקמה לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד.כדי להשיג קטעים לניתוח קריוסטט, לטבול ברצף את המוח בפתרונות סוכרוז מדורגים בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לריכוז לפני השימוש cryostat ב שלילי 22 מעלות צלזיוס כדי לקבל 40 מקטעי מיקרומטר, הצבת 10 עד 20 קטעים ל הבאר בצלחת שש באר המכיל PBS בתוספת 0.02% azide כפי שהם מתקבלים. לאחר שכל הדגימות נרכשו, אחסן את החלקים בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. כדי להשיג קטעים עבור ניתוח פרפין, לייבש רקמת המוח מנוון פוסט קבוע עם פתרונות אלכוהול מדורגים רציפים במשך שעתיים לריכוז, ואחריו שתי שעה אחת 100% אלכוהול טבילות ושתי טבילות קסילן שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר טבילת הקסילן האחרונה, לחדור את הרקמה עם קסילן אחד לאחד תווי פרפין פעמיים במשך שעה אחת לכל דגירה ב 56 מעלות צלזיוס בזכוכית חרוטית מכוסה רדיד אלומיניום לפני טבילת הרקמות ב 56 מעלות צלזיוס פרפין במשך ארבע עד שש שעות. בסוף הדגירה, להשתמש microtome סיבובי בטמפרטורת החדר כדי לקבל חמישה חלקים עבים מיקרומטר הצבת החלקים באמבט מים רקמת צלזיוס 45 מעלות כפי שהם נאספים. לתיוג כורכומין של לוחות עמילואיד בטא בקטעי רקמת קריוסטט, יש לשטוף את החלקים ב-PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות לכביסה לפני שאתנו את החלקים ב-70% אתנול לשתי דקות בטמפרטורת החדר.בעוד החלקים הם דגירה, להמיס מילימול אחד של כורכומין מלאי במתנול לדלל את הפתרון לריכוז עבודה סופי של 10 micromolar עם 70% אתנול. בסוף הדגירה, לטבול את החלקים בתסכום כורכומין עובד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ב 50 סיבובים לדקה. בסוף תקופת הכתמים, להשליך את תסכול הכורכומין ולשטוף את החלקים עם שלוש שתי דקות שטיפות 70%אתנול.לאחר הכביסה האחרונה, מעבירים את החלקים לשקופיות זכוכית מצופות פולינזין ומעבירים החלקת כיסוי על כל שקופית עם מדיום הרכבה אורגני מתאים. לאחר מכן הצג את הסעיפים במיקרוסקופ של florescence באמצעות מטרה של 10 או 20x ומסנני העירור וההפחתה המתאימים. לתיוג היסטוכימי של מקטעי רקמות פרפיניים עמוקים, טובלים את חמשת החלקים העבים של המיקרומטר בקסילן פעמיים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לטבילה, ולאחר מכן התייבשות עם טבילות בתווית אלכוהול דקה אחת.בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים עם פתרונות אלכוהול מדורגים במשך שתי דקות לריכוז ואחריו ניקוי עם שתי טבילות קסילן חמש דקות. לאחר טבילת הקסילן השנייה, הר כל קטע בשקופית מיקרוסקופ עם תלוש כיסוי ואמצעי הרכבה מתאים להדמיית מיקרוסקופיית פלורסנס כפי שהוכח. לתיוג של דגימות סעיף קריוסטט עם נוגדנים נגד A-beta, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS טרי לשטוף בארות בודדות של צלחת 12 באר לפני חסימת כל כריכה לא ספציפית עם 10% נורמלי סרום עזים PBS ו 0.5% טריטון x-100 במשך שעה בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להשליך את פתרון החסימה דגירה הדגימות עם נוגדן ספציפי a-beta לילה בארבע מעלות צלזיוס ו 150 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר, לשטוף את החלקים עם שלוש 10 דקות שטיפות PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו דגירה עם נוגדן משני מתאים גדוש פלואורופור אדום במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם PBS ואחריו לשטוף אחד עם 70% אלכוהול.לאחר שטיפת האלכוהול, הדגירה את החלקים עם כורכומין 10 מיקרומולרי במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש דקות 70% אלכוהול שוטף. לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את החלקים עם 90%ו 100% אלכוהול במשך דקה אחת לכל ריכוז ולנקות את החלקים פעמיים במשך חמש דקות לטבילה עם קסילן טרי לכל דגירה. לאחר מכן תן ודמיין את המקטעים כפי שהוכח.עבור לוקליזציה תאית עמילואיד בטא שיתוף, להכתים את החלקים עם נוגדן בטא אנטי עמילואיד ואחריו כתמים עם כורכומין בטמפרטורת החדר ו 50 סיבובים לדקה מוגן מפני אור כפי שהוכח. בסוף הדגירה, יש להתגשם בצבע גרעיני מתאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ו-50 סיבובים לדקה המוגנים מפני אור ואחריו שלוש שטיפות ב-PBS. לאחר מכן הר ודמיין את החלקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כפי שהוכח.למרות הגדלת זמן הדגירה עם כורכומין מעט מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של לוחות בטא A, מספר הלוחות שנצפו אינו שונה באופן משמעותי בין אחת לחמש דקות של זמן הכתם. כורכומין יכול לשמש כדי להכתים לוחות בטא ו cryosectioned, פרפין מוטבע, ודגימות רקמת מחלת אלצהיימר אנושית. תיוג עם נוגדן ספציפי בטא לפני כתמי כורכומין מגלה כי הכורכומין הוא מקומי לחלוטין עם בטא באותם לוחות שקושרים את הנוגדן.לאחר הכתמה עם כורכומין שכותרתו אוליגומרים בטא, כורכומין שיתוף לוקליזציה עם אוליגומרים ניתן לראות לוחות בטא. באופן דומה, כורכומין גם שיתוף לוקליזציה עם נוגדן מסוים בטא בחללים תאיים, המאשר כי הכתם יכול תווית בטא תאית A. תיוג כורכומין בולט גם יותר צבעים עמילואיד קונבנציונלי מחייב.נגזרות כורכומין נמצאו תמציות tumeric תווית לוחות בטא יחסית כורכומין ברקמת המוח מחלת אלצהיימר אנושית ללא קשר לסוג של מדיום הרכבה בשימוש. בנוסף, אותות immunofluorescence כורכומין ועוצמת נגד נשמרים גם לאחר הכתם עם כתמים גרעיניים טיפוסי סמני תאים אחרים. פגשנו כי חלקים קבועים צריכים להיות דקים יותר מ 40 מיקרון.הליך אימון זה צריך להישמר תחת 30 דקות ואת ריכוז הכורכומין האופטימלי הוא אחד עד שני micromolar. סמנים ביולוגיים מפגרים בהפלה כפולה יכולים להתבצע על אותה רקמה יכולים לספק ספציפיות רבה יותר של אילו סוגים של תאי מוח מאוזנים. בהתחשב בכך כורכומין יכול להפחית את עומס רובד עמילואיד, המנגנונים המדויקים של איך תהליך זה מתרחש נחקר כעת הן ברמה התאית והן ברמה המולקולרית.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Neuroscience

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain (Video) | JoVE

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus (Video) | JoVE

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique (Video) | JoVE

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃŽÂ²-Amyloid Plaques (Video) | JoVE

גומל אור מיקרוסקופי אלקטרונים ללמוד microglial אינטראקציות עם הפלאק β-עמילואיד

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry (Video) | JoVE

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃŽÂ² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry (Video) | JoVE

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃŽÂ² Effects in Cultured Mouse Neurons (Video) | JoVE

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK (Video) | JoVE

הדמיה של ATP תאיים בפרוסות רקמה אורגנותית של המוח העכבר באמצעות חיישן מבוסס-הסריג ATeam 1.03ימק

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture (Video) | JoVE

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal (Video) | JoVE

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...