Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
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Il sostegno a questo studio è venuto dal Field Neurosciences Institute di Ascension of St. Mary's.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Saginaw Valley State University. Il tessuto umano è stato ottenuto da una banca del cervello stabilito presso lo Banner Sun Health Institute in Arizona15,16.
1. Perfusione degli animali
<ol><li>Preparare i buffer fissativi e perfusione.<ol>
<li>Preparare il buffer di fosfato di sodio da 0,1 M aggiungendo 80 g di cloruro di sodio (NaCl),...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. 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L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. 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K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

La nostra ipotesi era che Cur potesse essere usato come il modo più veloce, semplice e meno costoso per etichettare e immaginile le placche A e az nel tessuto cerebrale dell'AD postmortem rispetto ad altri coloranti di legame amiloide classici, così come gli anticorpi specifici di Az. Gli obiettivi di questo studio erano determinare il tempo minimo necessario per etichettare e immagini le placche di Az da Cur nel tessuto cerebrale post mortem AD e determinare se Cur può essere utilizzato come alternativa agli anticorp...

Il morbo di Alzheimer (AD) è uno dei disturbi neurologici più comuni, legati all'età e progressivi e una delle principali cause di morte in tutto il mondo1,2. Apprendimento, memoria, e compromissione della cognizione, insieme a disturbi neuropsichiatrici, sono i sintomi comuni manifestati in AD3. Anche se l'eziologia dell'AD non è stata completamente chiarita, le prove genetiche, biochimiche e sperimentali disponibili indicano che la graduale deposizione di Ao è un biomarcatore definitivo per AD4. Questa proteina piegata male si accumula negli spazi intracellulari ed extracellulari ed è pensata per essere coinvolta nella perdita sinaptica, nell'aumento della neuroinfiammazione e nella neurodegenerazione nelle regioni corticali ed ippocampali nel cervello colpite daAD 5. Pertanto, il rilevamento istochimico di A , nel tessuto AD, è un primo passo fondamentale nello sviluppo di farmaci anti-amiloidi non tossici per prevenire la progressione dell'AD.
Nel corso degli ultimi decenni, diversi coloranti e anticorpi sono stati utilizzati da molti laboratori di ricerca per etichettare e immagini le placche A - nel tessuto cerebrale, ma alcuni di questi metodi richiedono molto tempo e i coloranti o gli anticorpi utilizzati sono costosi, richiedendo diversi accessori Prodotti chimici. Pertanto, lo sviluppo di un mezzo economico di rilevamento delle placche di AC nel cervello AD sarebbe un nuovo strumento gradito. Molti laboratori hanno iniziato a utilizzare Cur, un promettente polifenolo naturale anti-amiloide, per l'etichettatura e l'imaging di A, nonché un agente terapeutico per AD6,7,8,9. La sua idropobicità e la natura lofilica, le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi classici, la forte attività fluorescente, così come la forte affinità da legare con l'Az lo rendono un fluoroforo ideale per l'etichettatura e l'imaging delle placche di A . Cur si lega con le placche az e oligomeri e la sua presenza viene rilevata anche negli spazi intracellulari7,11,12,13. Inoltre, è stato dimostrato che una quantità minima di Cur può etichettare le placche affar-Alzheimer familiari 5x (5xFAD)7. Anche se la concentrazione di 1 nM non fornisce l'intensità di fluorescenza ottimale per il conteggio delle placche di Ao, una concentrazione di 10 nM o superiore di Cur fa. Ran e colleghi14 hanno riferito che dosi a partire da 0,2 nM di Cur derivato da difluoroboron sono in grado di rilevare i depositi in vivo di A, quasi come una sonda a infrarossi. Non è ancora chiaro se questa dose sia sufficiente per etichettare le placche di Az nei tessuti. La maggior parte degli studi precedenti ha utilizzato 20-30 min per colorare le placche di Az usando Cur, ma la colorazione ottimale può richiedere molto meno tempo.
Il presente studio è stato progettato per testare il tempo minimo richiesto da Cur per etichettare le placche di Az nel tessuto cerebrale dell'AD e per confrontare la sensibilità per l'etichettatura e l'imaging delle placche di A, dai topi 5xFAD dopo la colorazione con Cur con altri Coloranti leganti a z, come Thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC). La capacità di etichettatura di questi classici coloranti di legame amiloide è stata confrontata con la colorazione in sezioni cerebrali coronariche incorporate in paraffina e criostati da topi 5xFAD e da tessuto umano e di controllo del cervello. I risultati suggeriscono che Cur etichetta le placche di Az in modo simile agli anticorpi specifici di A - (6E10) e moderatamente migliore di Thio-S, CR o FJC. Inoltre, quando sono state somministrate iniezioni intraperiteali di topi Cur to 5xFAD per 2/5 giorni, ha attraversato la barriera emato-encefalica e legato con placche ad Ao7. È interessante notare che, le concentrazioni nanomolare di Cur sono state utilizzate per etichettare e l'immagine placche di Ao nel tessuto cerebrale 5xFAD7,14. Inoltre, le placche di A, come le placche di nucleo, neuritiche, diffuse e bruciate, possono essere etichettate da Cur in modo più efficiente rispetto a qualsiasi altro colorante di legame amiloide convenzionale7. Nel complesso, Cur può essere applicato per etichettare e immagini placche az in tessuto cerebrale post-mortem da modelli animali AD e/o tessuto AD umano in modo semplice ed economico, come alternativa affidabile agli anticorpi specifici di A.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

La deposizione di proteine beta amiloidi (A) in spazi extra e intracellulari è una delle patologie distintive del morbo di Alzheimer (AD). Pertanto, il rilevamento della presenza di A , nel tessuto cerebrale dell'AD, è uno strumento prezioso per lo sviluppo di nuovi trattamenti per prevenire la progressione dell'AD. Diversi coloranti di legame amiloide classici, fluorocro, sonde di imaging e anticorpi specifici per l'AO sono stati utilizzati per rilevare l'A - istochimicamente nel tessuto cerebrale dell'AD. L'uso di questi composti per il rilevamento di A - è costoso e richiede molto tempo. Tuttavia, a causa della sua intensa attività fluorescente, dell'alta affinità e della specificità per l'Az, così come le somiglianze strutturali con i coloranti leganti amiloidi tradizionali, la curcumina (Cur) è un promettente candidato per l'etichettatura e l'imaging delle placche A tessuto cerebrale. È un polifenolo naturale dell'erba Curcuma longa. Nel presente studio, Cur è stato utilizzato per etichettare istochimicamente placche di Az sia da un modello murino genetico della malattia di Alzheimer familiare 5x (5xFAD) e dal tessuto umano AD entro un minuto. La capacità di etichettatura di Cur è stata confrontata con i tradizionali coloranti di legame amiloide, come thioflavin-S (Thio-S), Congo rosso (CR) e Fluoro-jade C (FJC), così come gli anticorpi specifici di Az (6E10 e A11). Abbiamo osservato che Cur è il modo più economico e più veloce per etichettare e immagini le placche DiZ rispetto a questi coloranti convenzionali ed è paragonabile agli anticorpi specifici di A . Inoltre, Cur si lega con la maggior parte delle specie di A, come oligomeri e fibrille. Pertanto, Cur potrebbe essere utilizzato come l'agente di rilevamento fluorocro più conveniente, semplice e veloce per le placche A .

La curcumina etichetta le placche di Az entro un minuto. Quando abbiamo macchiato il tessuto 5xFAD con Cur, abbiamo scoperto che le placche Cur az sono all'interno di 1 min. Anche se l'aumento del tempo di incubazione con Cur ha leggermente aumentato l'intensità di fluorescenza delle placche di Ao, il numero di placche di Az osservate non era significativamente diverso tra 1 min e 5 min di colorazione (Figura 1).
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Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

La curcumina è un fluoroforo ideale per l'etichettatura e l'imaging di placche proteiche beta amiloidi nel tessuto cerebrale a causa del suo legame preferenziale alla proteina beta amiloide e delle sue somiglianze strutturali con altri coloranti di legame amiloidi tradizionali. Può essere utilizzato per etichettare e immagini placche proteiche beta amiloidi in modo più efficiente ed economico rispetto ai metodi tradizionali.

Etichettatura e imaging di placche amiloidi nel tessuto cerebrale utilizzando la curcumina polifenolo naturale

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Questo protocollo è il metodo più efficiente ed economico per etichettare accuratamente le placche beta-amiloide, rispetto agli anticorpi specifici dell'amiloide, che sono attualmente il gold standard per l'etichettatura di queste placche. Questa tecnica richiede meno tempo ed è altrettanto efficace di uno qualsiasi dei metodi di etichettatura amiloide comunemente usati. La curcumina si lega fortemente alle placche amiloide e può essere utilizzata come sonda di imaging durante le scansioni PET del cervello e per screening relativamente non invasivi utilizzando la scansione retinica.La curcumina si lega anche al neurofibrillare o al groviglio tau nel morbo di Alzheimer, alla sinuleina alfa nel morbo di Parkinson e alle proteine mutanti di Huntington nella malattia di Huntington. A dimostrare la procedura con Panchanan Maiti ci saranno Zackary Bowers, una studentessa laureata, e Alexandra Plemmons, una ricercatrice del mio laboratorio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del dolore in un topo modello anestetizzato del morbo di Alzheimer di 12 mesi, posizionare il topo in posizione supina su un vassoio chirurgico e fare un'incisione nell'addome e attraverso il diaframma.Inserire un ago perfusione calibro 21 nell'incisione e fare una piccola incisione al padiglione auricolare destro per consentire al fluido perfusione di drenare dal corpo. Utilizzare un sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire al fluido PBS molare ghiacciato da 0,1 per fluire nell'ago per cinque o sei minuti a una portata da 20 a 25 millilitri al minuto. Se la perfusione viene eseguita correttamente, si osserverà un fegato chiaro.Una corretta perfusione animale è essenziale perché se il sangue non viene rimosso completamente, la curcumina può legarsi ai vasi sanguigni e provocare un segnale di fondo fluorescente verde. Una volta che tutto il PBS è stato consegnato, passare la valvola tampone a una soluzione di paraformaldeide al 4% ghiacciata per otto-10 minuti prima di utilizzare forbici e forcep per liberare il cervello dal cranio. Quindi utilizzare una spatola per posizionare il cervello in una fiala del 4% di paraformaldeide almeno 10 volte il volume del tessuto per quattro gradi celsius di conservazione fino all'elaborazione.Per ottenere sezioni per la sessatura del criostato, immergere in sequenza il cervello in soluzioni di saccarosio graduato a quattro gradi Celsius per 24 ore per concentrazione prima di utilizzare un criostato a -22 gradi celsius per ottenere sezioni di 40 micrometri, posizionando da 10 a 20 sezioni per pozzo in una piastra di sei pozzi contenente PBS integrata con lo 0,02% di azide man mano che si ottengono. Una volta acquisiti tutti i campioni, conservare le sezioni a quattro gradi celsius fino a un'ulteriore elaborazione. Per ottenere sezioni per la sessatura di paraffina, disidratare il tessuto cerebrale perfuso post-fisso con soluzioni di alcol graduato sequenziale per due ore per concentrazione, seguito da due immersioni al 100% di alcol di un'ora e due immersioni in xilene di un'ora a temperatura ambiente.Dopo l'ultima immersione in xilene, penetrare nel tessuto con una soluzione da uno a uno di xilene per paraffina due volte per un'ora per incubazione a 56 gradi celsius in un vetro conico di vetro ricoperto di foglio di alluminio prima di immergere i tessuti in paraffina di 56 gradi celsius per quattro o sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare un microtomo rotante a temperatura ambiente per ottenere cinque sezioni spesse cinque micrometri posizionando le sezioni in un bagno d'acqua tissutale di 45 gradi Celsius man mano che vengono raccolte. Per l'etichettatura della curcumina delle placche beta amiloide nelle sezioni del tessuto criostato, sciacquare le sezioni con PBS tre volte per cinque minuti per lavaggio prima di immergere le sezioni in etanolo al 70% per due minuti a temperatura ambiente.Mentre le sezioni sono in incubazione, sciogliere un millimolare di curcumina stock in metanolo e diluire la soluzione a una concentrazione di lavoro finale di 10 micromolare con 70% di etanolo. Al termine dell'incubazione, immergere le sezioni nella soluzione di curcumina di lavoro per 10 minuti a temperatura ambiente a 50 rotazioni al minuto. Al termine del periodo di colorazione, scartare la soluzione di curcumina e lavare le sezioni con tre lavaggi di due minuti in etanolo al 70%.Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le sezioni su vetri rivestiti in polilisina e montare un coperchio su ogni scivolo con un mezzo di montaggio organico appropriato. Quindi visualizzare le sezioni su un microscopio a florescence utilizzando un obiettivo 10 o 20x e gli opportuni filtri di eccitazione ed emissione. Per l'etichettatura istochimica di sezioni di tessuto paraffinato profondo, immergere le sezioni spesse cinque micrometri in xilene due volte per cinque minuti a temperatura ambiente per immersione, seguite da reidratazione con immersioni in soluzione alcolica di un minuto graduate.Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni con soluzioni alcoliche classificate per due minuti per concentrazione seguite da schiarite con due immersioni in xilene di cinque minuti. Dopo la seconda immersione in xilene, montare ogni sezione su uno scivolo al microscopio con un coperchio e un mezzo di montaggio appropriato per l'imaging della microscopia a florescence, come dimostrato. Per l'etichettatura di campioni di sezione criostatica con anticorpi anti-A-beta, lavare i campioni tre volte con PBS fresco per lavaggio in singoli pozzi di una piastra di 12 pozza prima di bloccare qualsiasi legame non specifico con siero di capra normale al 10% in PBS e 0,5% tritone x-100 per un'ora a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione di blocco e incubare i campioni con anticorpi specifici a beta durante la notte a quattro gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto. La mattina seguente, lavare le sezioni con tre lavaggi di 10 minuti in PBS fresco per lavaggio, seguito da incubazione con un anticorpo secondario appropriato coniugato con un fluoroforo rosso per un'ora a temperatura ambiente protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni tre volte con PBS seguito da un lavaggio con 70% di alcol.Dopo il lavaggio dell'alcol, incubare le sezioni con 10 curcumina micromolare per 10 minuti a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi al 70% alcool di un minuto. Dopo l'ultimo lavaggio, disidratare le sezioni con 90% e 100% di alcol per un minuto per concentrazione e sgombro le sezioni due volte per cinque minuti per immersione con xilene fresco per incubazione. Quindi montare e immagini le sezioni come dimostrato.Per la co-localizzazione beta amiloide intracellulare, macchiare le sezioni con anticorpo beta anti amiloide seguita dalla colorazione con curcumina a temperatura ambiente e 50 rotazioni al minuto protette dalla luce come dimostrato. Al termine dell'incubazione, controsostenere con un colorante nucleare appropriato per 10 minuti a temperatura ambiente e 50 rotazioni al minuto protette dalla luce seguite da tre lavaggi in PBS. Quindi montare e imageare le sezioni mediante microscopia a fluorescenza come dimostrato.Sebbene l'aumento del tempo di incubazione con curcumina aumenti leggermente l'intensità di fluorescenza delle placche beta A, il numero di placche osservate non è significativamente diverso tra uno e cinque minuti di tempo di colorazione. La curcumina può essere utilizzata per macchiare le placche beta A e i campioni di tessuto criosezione, paraffina incorporata e morbo di Alzheimer umano. L'etichettatura con un anticorpo beta specifico prima della colorazione della curcumina rivela che la curcumina è completamente co-localizzata con una beta alle stesse placche che legano l'anticorpo.Dopo la colorazione con curcumina etichettata come oligomeri beta, la co-localizzazione della curcumina con gli oligomeri può essere osservata in placche beta A. Allo stesso modo, la curcumina co-localizza anche con l'anticorpo A beta specifico negli spazi intracellulari, confermando che la macchia può etichettare la beta intracellulare A. L'etichettatura della curcumina è anche più prominente dei coloranti convenzionali per legatura amiloide.I derivati della curcumina presenti negli estratti tumerici etichettano le placche beta A relativamente alla curcumina nel tessuto cerebrale del morbo di Alzheimer umano, indipendentemente dal tipo di mezzo di montaggio utilizzato. Inoltre, i segnali di immunofluorescenza della curcumina e l'intensità di controsottenimento vengono mantenuti anche dopo la colorazione con le tipiche macchie nucleari e altri marcatori cellulari. Abbiamo incontrato che le sezioni costanti dovrebbero essere più sottili di 40 micron.Questa procedura di allenamento deve essere mantenuta sotto i 30 minuti e la concentrazione ottimale di curcumina è da uno a due micromolare. I biomarcatori ritardati a doppio livellamento possono essere eseguiti sullo stesso tessuto e possono fornire una maggiore specificità di quali tipi di cellule cerebrali vengono livellati. Dato che la curcumina può ridurre il carico della placca amiloide, i meccanismi precisi di come si verifica questo processo sono attualmente allo studio sia a livello cellulare che molecolare.

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