Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
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この研究のサポートは、セントメアリーズの昇天のフィールド神経科学研究所から来ました.

ここで説明するすべての方法は、サギノーバレー州立大学の動物ケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています.ヒト組織は、アリゾナ州のバナーサンヘルス研究所で確立された脳バンクから得られた15,16.
1. 動物の灌流
<ol><li>固定バッファーと灌流バッファーを準備します。<ol>
<li>0.1 M 塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム2g(...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Curcumin,+a+Natural+Polyphenol+for+Targeting+Molecular+Pathways+in+Treating+Age-Related+Neurodegenerative+Diseases.">Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+curcumin+forms+selectively+bind+fibrillar+amyloid+beta+in+post+mortem+Alzheimer's+disease+brains:+Implications+for+in-vivo+diagnostics.">Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).</li><li>Koronyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+amyloid+pathology+and+proof-of-concept+imaging+trial+in+Alzheimer's+disease.">Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease.</a> JCI Insight. 2 (16), (2017).</li><li>Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subregions+of+the+inferior+parietal+lobule+are+affected+in+the+progression+to+AD.">Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD.</a> Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).</li><li>Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+has+potent+anti-amyloidogenic+effects+for+Alzheimer's+beta-amyloid+fibrils+in+vitro.">Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro.</a> Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).</li><li>Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+labels+amyloid+pathology+in+vivo,+disrupts+existing+plaques,+and+partially+restores+distorted+neurites+in+an+Alzheimer+mouse+model.">Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model.</a> Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).</li><li>Mutsuga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+curcumin+to+senile+plaques+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+the+aged+brain+of+various+animals+and+to+neurofibrillary+tangles+in+Alzheimer's+brain.">Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).</li><li>Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

私たちの仮説は、Curが他の古典的なアミロイド結合色素と比較して、死後AD脳組織におけるAβプラークを標識し、画像化する最も速く、最も簡単で、最も安価な方法として使用することができ、Aβ特異的抗体と比較して行うことができた。本研究の目的は、死後AD脳組織におけるCurによるAβプラークの標識および画像化に要する最小時間を決定し、CurがAβプラークを標識するためのAβ抗体の代...

アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な、年齢関連、進行性神経疾患の一つであり、世界的に死亡の主要な原因の一つである1、2。学習、記憶、認知障害は、神経精神障害と共に、AD3に現れる一般的な症状である。ADの病因は完全には解明されていないが、利用可能な遺伝的、生化学的、および実験的証拠は、Aβの段階的な沈着がAD4の決定的なバイオマーカーであることを示す。この誤った折り畳まれたタンパク質は、細胞内および細胞外空間に蓄積し、AD5の影響を受ける脳の皮質および海馬領域におけるシナプス損失、神経炎症の増加、および神経変性に関与すると考えられている。したがって、AD組織におけるAβの組織化学的検出は、ADの進行を防ぐために非毒性、抗アミロイド薬を開発する上で重要な第一歩である。
過去数十年の間に、いくつかの染料および抗体は、脳組織のAβプラークを標識および画像化するために多くの研究所で使用されてきましたが、これらの方法のいくつかは時間がかかり、使用される染料や抗体は高価であり、いくつかの付属品を必要とします化学 物質。したがって、AD脳におけるAβプラークの検出の安価な手段の開発は、歓迎される新しいツールであろう。多くの研究室は、Aβの標識およびイメージングのための有望な抗アミロイド天然ポリフェノールであるCur、ならびにAD6、7、8、9の治療薬を使用し始めました。その疎水性と好中性、古典的なアミロイド結合色素との構造的な類似性、強い蛍光活性、ならびにAβと結合する強い親和性は、AD組織10におけるAβプラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素を作る.CurはAβプラークおよびオリゴマーと結合し、その存在はまた、細胞内空間7、11、12、13においても検出される。さらに、Curの最小量(1−10nM)は、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)脳組織7においてAβプラークを標識できることが示されている。1nM濃度はAβプラークの計数に最適な蛍光強度を提供しないが、Curの10nM以上の濃度を有する。ランと同僚14は、ジフルオロボロン誘導体化Curの0.2 nMの低用量が、赤外線プローブとほぼ同様に生体内のAβ沈着物を検出できることを報告した。この用量が組織中のAβプラークを標識するのに十分であるかどうかはまだ明らかではない。これまでの研究のほとんどは、Curを使用してAβプラークを染色するために20−30分を使用していますが、最適な染色は、はるかに少ない時間を必要とするかもしれません。
本研究は、CURがAD脳組織のAβプラークにラベルを付け、他の従来のCurで染色した後の5xFADマウスからの脳組織におけるAβプラークの標識およびイメージングに対する感受性を比較するために必要な最小時間をテストすることを目的とした。チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴ赤(CR)、フルオロジェイドC(FJC)などのAβ結合性染料。これらの古典的なアミロイド結合色素のAβ標識能力は、5xFADマウスおよび老化一致したヒトADおよび制御脳組織からのパラフィン埋め込みおよび凍結石コロナ脳切片における硬化染色と比較された。この知見は、CurがAβ特異的抗体(6E10)と同様の方法でAβプラークを標識し、チオS、CR、またはFJCよりも適度に優れていることを示唆している。また、5xFADマウスに対する心腹腔内注射を2〜5日間投与した場合、血液脳関門を通過し、Aβプラーク7と結合した。興味深いことに、Curのナノモル濃度は、5xFAD脳組織7、14におけるAβプラークの標識および画像に使用されている。さらに、形態学的に異なるAβプラークは、コア、神経学的、拡散、および焼失したプラークを、他の従来のアミロイド結合色素7のいずれよりも効率的にCurによって標識することができる。全体的に、Curは、Aβ特異的抗体に対する信頼性の高い代替として、AD動物モデルおよび/またはヒトAD組織からの死後脳組織における標識および画像Aβプラークに容易かつ安価な方法で適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

細胞外および細胞内空間におけるアミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着は、アルツハイマー病(AD)の顕著な病理の一つである。したがって、AD脳組織におけるAβの存在の検出は、ADの進行を防止するための新しい治療法を開発するための貴重なツールである。いくつかの古典的なアミロイド結合色素、フルオロクロム、イメージングプローブ、およびAβ特異的抗体がAD脳組織においてAβ組織化学的に検出するために使用されている。Aβ検出のためのこれらの化合物の使用は、コストと時間がかかります。しかし、その強烈な蛍光活性、高親和性、およびAβの特異性、ならびに従来のアミロイド結合色素との構造的類似性のために、クルクミン(Cur)は死後のAβプラークの標識およびイメージングのための有望な候補である脳組織。ハーブクルクマロンガから天然ポリフェノールです。本研究では、Curは、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)の遺伝的マウスモデルと1分以内にヒトAD組織の両方からAβプラークを組織化学的に標識するために使用された。Curの標識能力は、チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴレッド(CR)、フルオロジェイドC(FJC)、ならびにAβ特異的抗体(6E10およびA11)などの従来のアミロイド結合色素と比較した。Curは、これらの従来の染料と比較して、Aβプラークを標識および画像化する最も安価で迅速な方法であり、Aβ特異的抗体に匹敵することを観察しました。さらに、CurはオリゴマーやフィブリルなどのほとんどのAβ種と結合する。したがって、Curは、Aβプラークの最も費用対効果が高く、シンプルで迅速なフルオロクロム検出剤として使用することができる。

クルクミンは1分以内にAβプラークをラベル付けします。5xFAD組織をCurで染色したところ、1分以内にCur標識Aβプラークが見つかった。Curによるインキュベーション時間の増加はAβプラークの蛍光強度をわずかに増加させるが、観察されたAβプラークの数は1分と5分の染色時間の間で有意に異なっていなかった(図1)。
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

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Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

クルクミンは、アミロイドベータタンパク質への優先結合、ならびに他の伝統的なアミロイド結合色素との構造的類似性に起因する脳組織におけるアミロイドベータタンパク質プラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素である。これは、従来の方法よりも効率的かつ安価にアミロイドベータタンパク質プラークをラベル付けし、画像化するために使用することができます。

天然ポリフェノールクルクミンを用いた脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

このプロトコルは、現在これらのプラークを標識するためのゴールドスタンダードであるアミロイド特異的抗体と比較して、β-アミロイドプラークを正確に標識するための最も効率的かつ費用対効果の高い方法です。この手法は、一般的に使用されるアミロイドラベリング方法と同様に、より少ない時間を要し、同様に効果的です。クルクミンはアミロイドプラークに強く結合し、脳のPETスキャン中および肛門走査を用いた比較的非侵襲的スクリーニングのためにイメージングプローブとして使用することができる。クルクミンはまた、アルツハイマー病の神経原性またはタウのもつれに結合します, パーキンソン病のアルファシヌクレイン, ハンチントン病の変異ハンチントンのタンパク質.パンチャナン・マイティとの手順を実証するのは、大学院生のザッカリー・バウワーズと、私の研究室の研究科学者アレクサンドラ・プレモンズです。麻酔後12ヶ月のアルツハイマー病モデルマウスでの疼痛反射への応答の欠如を確認した後、手術トレイの上の位置にマウスを置き、腹部と横隔膜を通して切開を行う。21ゲージの灌流針を切開に挿入し、右耳通りに小さな切開を行い、灌流液が体内から排出されるようにします。重力供給灌流システムを使用して、氷冷0.1モルPBS流体が毎分20〜25ミリリットルの流量で5〜6分間針に流れ込むことを可能にする。灌流が正しく行われれば、明確な肝臓が観察される。血液が完全に除去されない場合、クルクミンは血管に結合し、緑色の蛍光背景信号を生じる可能性があるため、適切な動物の灌流が不可欠です。すべてのPBSが配信されたら、バッファーバルブを氷冷4%パラホルムアルデヒド溶液に8〜10分間切り替えてから、はさみと鉗子を使用して頭蓋骨から脳を解放します。その後、ヘラを使用して、処理するまで摂氏4度の貯蔵のための組織体積の少なくとも10倍の4%パラホルムアルデヒドのバイアルに脳を配置します。クライオスタット断法のセクションを得るために、摂氏22度のクライオスタットを使用して40マイクロメートルのセクションを得る前に、1濃度あたり24時間4度の段階的なショ糖溶液に脳を順次浸漬し、0.02%アジドで補うPBSを含む6つのウェルプレートに1ウェルあたり10〜20セクションを配置する。すべてのサンプルを取得したら、さらに処理するまで4°Cでセクションを保管してください。パラフィン切片の切片を得るために、濃度あたり2時間連続的に等級アルコール溶液を有する後固定パーフューズド脳組織を脱水し、続いて室温で1時間100%アルコール浸漬2回、1時間のキシレン浸漬を2回行う。最後のキシレン浸漬後、アルミニウム箔で覆われたガラス円錐形ガラスで摂氏56度で1回1~1キシレン溶液をパラフィン溶液に2回、4〜6時間浸透させる。インキュベーションの終わりに、室温で回転式ミクロトームを使用して、45°Cの組織水浴にセクションを配置する5マイクロメートルの厚いセクションを得る。クライオスタット組織切片におけるアミロイドベータプラークのクルクミン標識の場合、PBSで切片を洗浄1回5分間3回リンスしてから、70%エタノールに分を室温で2分間浸漬します。切片がインキュベートしている間、ストッククルクミンの1ミリモルをメタノールで溶解し、70%エタノールで10マイクロモルの最終的な作業濃度に溶液を希釈する。インキュベーションの終了時に、1分間に50回転で室温で10分間、作業クルクミン溶液にセクションを浸します。染色期間の終わりに、クルクミン溶液を捨て、70%エタノールで3回の2分間の洗浄でセクションを洗浄します。最後の洗浄後、セクションをポリリシンコーティングガラススライドに移し、適切な有機実装媒体を使用してカバースリップを各スライドに取り付けます。その後、10または20xの目的と適切な励起および放出フィルタを使用して、蛍光顕微鏡上のセクションを表示します。深いパラフィン化された組織切片の組織化学的標識の場合、5マイクロメートルの厚い切片を浸漬1回の室温で5分間、次に1分間のアルコール溶液浸漬で水分補給を行います。インキュベーションの最後に、濃度あたり2分間、等級アルコール溶液でセクションを洗浄し、続いて2つの5分間のキシレン浸漬でクリアします。2番目のキシレン浸漬後、各セクションを顕微鏡スライドに取り付け、蓋スリップと蛍光顕微鏡イメージング用の適切な実装媒体を使用します。抗A-β抗体によるクライオスタットセクション標本の標識の場合、PBSで10%正常なヤギ血清、室温で1時間0.5%トリトンx-100の非特異的結合を遮断する前に、12ウェルプレートの個々のウェルで1回の洗浄ごとに新鮮なPBSでサンプルを3回洗浄します。インキュベーションの終了時に、ブロッキング溶液を廃棄し、1分間に摂氏4度と150回転で一晩a-β特異的抗体でサンプルをインキュベートします。翌朝、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の10分間の洗浄で切片を洗浄し、続いて赤いフルオロフォアと共役した適切な二次抗体を光から保護した室温で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、PBSでセクションを3回洗い、続いて70%アルコールで1回洗浄します。アルコール洗浄後、10マイクロモルクルクミンを室温で10分間インキュベートし、その後3回1分間70%アルコール洗浄を行います。最後の洗浄後、90%と100%アルコールで濃度1分間脱水し、インキュベーションごとに新鮮なキシレンで浸漬ごとに5分間セクションを2回クリアします。次に、説明したようにセクションをマウントしてイメージします。細胞内アミロイドβ共局在化の場合、抗アミロイドベータ抗体でセクションを染色し、続いて室温でクルクミンを染色し、光から保護された毎分50回転を行います。インキュベーションの終わりには、適切な核染料を用いて、室温で10分間、1分間に50回転の光から保護し、続いてPBSで3回の洗剤を行う。次に、示すように蛍光顕微鏡でセクションをマウントして画像化します。クルクミンによるインキュベーション時間を増加させるとAベータプラークの蛍光強度がわずかに増加するが、観察されたプラークの数は1分と5分間の染色時間の間で有意に異ならない。クルクミンは、ベータプラークおよび凍結切除、パラフィン埋め込み、およびヒトアルツハイマー病組織サンプルを染色するために使用することができる。クルクミン染色前にβ特異的抗体と標識すると、クルクミンが抗体を結合する同じプラークでAベータと完全に共局化することが明らかになる。ベータオリゴマーとラベル付けされたクルクミンで染色した後、オリゴマーとのクルクミン共局在化はAベータプラークで観察することができる。同様に、クルクミンはまた、細胞内空間におけるAβ特異的抗体と共局化し、その染色が細胞内Aベータに標識できることを確認する。クルクミン標識はまた、従来のアミロイド結合色素よりも顕著である。タメリック抽出物に見られるクルクミン誘導体は、使用される取り付け培地の種類に関係なく、ヒトアルツハイマー病の脳組織におけるクルクミンに比較的βプラークをラベルします。また、クルクミン免疫蛍光シグナルや反染色強度は、典型的な核染色や他の細胞マーカーで染色した後も維持されます。私たちは、定数セクションが40ミクロンよりも薄くする必要があることを見た。このトレーニング手順は30分以下に保つ必要があり、最適なクルクミン濃度は1〜2マイクロモルです。二重レベリング遅滞バイオマーカーは、同じ組織上で行うことができるし、脳細胞のレベル化されている脳細胞の大きな特異性を提供することができます.クルクミンがアミロイドプラークの負荷を軽減できることを考えると、このプロセスがどのように起こるかの正確なメカニズムは、現在、細胞レベルと分子レベルの両方で調査されています。

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SCIENTISTS IN ACTION

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

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Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

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Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

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マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

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Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

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Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

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Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

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