Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
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El apoyo a este estudio vino del Instituto de Neurociencias de Campo en ascensión de Santa María.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad Estatal del Valle de Saginaw. El tejido humano se obtuvo de un banco cerebral establecido en el Instituto Banner Sun Health en Arizona15,16.
1. Perfusión de los animales
<ol><li>Prepare los búferes fijador y de perfusión.<ol>
<li>Preparar un tampón de fosfato sódico de 0,1 M añadiendo 80 g de cloruro sódic...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Curcumin,+a+Natural+Polyphenol+for+Targeting+Molecular+Pathways+in+Treating+Age-Related+Neurodegenerative+Diseases.">Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. 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L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. 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K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

Nuestra hipótesis era que Cur podría ser utilizado como la forma más rápida, más fácil y menos costosa de etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral postmortem AD en comparación con otros colorantes clásicos de unión amiloide, así como anticuerpos específicos de A. Los objetivos de este estudio fueron determinar el tiempo mínimo necesario para etiquetar e imágenes de placas A- por Cur en el tejido cerebral postmortem AD y determinar si Cur puede ser utilizado como una alternativa al anticuerpo A...

La enfermedad de Alzheimer es uno de los trastornos neurológicos progresivos más comunes, relacionados con la edad y una de las principales causas de muerte en todo el mundo1,2. El aprendizaje, la memoria y el deterioro de la cognición, junto con los trastornos neuropsiquiátricos, son los síntomas comunes manifestados en ad3. Aunque la etiología de la AD no ha sido completamente aclarada, la evidencia genética, bioquímica y experimental disponible indica que la deposición gradual de A es un biomarcador definitivo para AD4. Esta proteína minimizada se acumula en espacios intracelulares y extracelulares y se cree que está implicada en la pérdida sináptica, aumento de la neuroinflamación y neurodegeneración en las regiones corticales y del hipocampo en el cerebro afectado por el centro de la enfermedad5. Por lo tanto, la detección histoquímica de A en el tejido AD es un primer paso crucial en el desarrollo de fármacos antiamiloides no tóxicos para prevenir la progresión de la AD.
Durante las últimas décadas, varios colorantes y anticuerpos han sido utilizados por muchos laboratorios de investigación para etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral, pero algunos de estos métodos consumen mucho tiempo y los colorantes o anticuerpos utilizados son caros, lo que requiere varios accesorios Productos químicos. Por lo tanto, el desarrollo de un medio barato de detección de placas A en el cerebro AD sería una nueva herramienta bienvenida. Muchos laboratorios comenzaron a utilizar Cur, un prometedor polifenol natural antiamiloide, para el etiquetado y la imagen A, así como un agente terapéutico para AD6,7,8,9. Su hidrofobicidad y naturaleza lipolólica, similitudes estructurales con colorantes clásicos de unión amiloide, fuerte actividad fluorescente, así como una fuerte afinidad para unirse con A, lo convierten en un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A- en el tejido AD10 . Cur se une a las placas y oligómeros A- y su presencia también se detecta en los espacios intracelulares7,11,12,13. Además, se ha demostrado que cantidades mínimas (1-10 nM) de Cur pueden etiquetar placas a a en 5 x tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer familiar (5xFAD)7. Aunque la concentración de 1 nM no proporciona la intensidad de fluorescencia óptima para el recuento de placas de A, una concentración de 10 nM o superior de Cur sí lo hace. Ran y sus colegas14 informaron que dosis tan bajas como 0,2 nM de Cur difluoroboron-derivatizado pueden detectar depósitos in vivo A, casi así como una sonda infrarroja. Aún no está claro si esta dosis es suficiente para etiquetar las placas a a- en el tejido. La mayoría de los estudios previos han utilizado de 20 a 30 minutos para manchar placas de A con Cur, pero la tinción óptima puede requerir mucho menos tiempo.
El presente estudio fue diseñado para probar el tiempo mínimo requerido por Cur para etiquetar las placas a-a en el tejido cerebral AD y para comparar la sensibilidad para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A en el tejido cerebral de los ratones 5xFAD después de manchar con Cur con otros Colorantes de unión A, como Thioflavin-S (Thio-S), rojo congoso (CR) y Fluoro-jade C (FJC). La capacidad de etiquetado A de estos colorantes clásicos de unión amiloide se comparó con la tinción de Cur en secciones cerebrales coronales incrustadas en parafina y criostatos de ratones 5xFAD y de AD humano emparejados con edad y tejido cerebral de control. Los hallazgos sugieren que Cur etiqueta las placas A- de una manera similar a los anticuerpos específicos de A - (6E10) y moderadamente mejor que Thio-S, CR, o FJC. Además, cuando se administraron inyecciones intraperitoneales de ratones Cur a 5xFAD durante 2 a 5 días, cruzó la barrera hematoencefálica y se une con placasA- 7. Curiosamente, las concentraciones nanomolares de Cur se han utilizado para etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral 5xFAD7,14. Por otra parte, las placas morfológicamente distintas de A, como las placas de núcleo, néríticas, difusas y quemadas pueden ser etiquetadas por Cur de manera más eficiente que con cualquiera de los otros colorantes de unión amiloide convencionales7. En general, Cur se puede aplicar a las placas de la etiqueta y de la imagen a-A en el tejido cerebral postmortem de los modelos animales AD y/o tejido AD humano de una manera fácil y barata, como una alternativa confiable a los anticuerpos específicos de A.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

La deposición de la proteína beta amiloide (A) en espacios extra e intracelulares es una de las patologías distintivas de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la detección de la presencia de A en el tejido cerebral AD es una herramienta valiosa para el desarrollo de nuevos tratamientos para prevenir la progresión de la AD. Se han utilizado varios colorantes clásicos de unión amiloide, fluorocromo, sondas de imagen y anticuerpos específicos de A- para detectar histoquímicamente A en el tejido cerebral AD. El uso de estos compuestos para la detección de A es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, debido a su intensa actividad fluorescente, alta afinidad y especificidad para A, así como similitudes estructurales con los colorantes tradicionales de unión amiloide, la curcumina (Cur) es un candidato prometedor para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de A en postmortem tejido cerebral. Es un polifenol natural de la hierba Curcuma longa. En el presente estudio, Cur se utilizó para etiquetar histoquímicamente placas A- tanto de un modelo genético de ratón de la enfermedad de Alzheimer 5x familial (5xFAD) como del tejido AD humano en un minuto. La capacidad de etiquetado de Cur se comparó con los colorantes de unión amiloide convencionales, como el tioflavina-S (Thio-S), el rojo del Congo (CR) y el Fluoro-jade C (FJC), así como con los anticuerpos específicos de A- (6E10 y A11). Observamos que Cur es la forma más económica y rápida de etiquetar e imágenes de placas A- en comparación con estos colorantes convencionales y es comparable a los anticuerpos específicos de A. Además, Cur se une a la mayoría de las especies de A, como los oligómeros y las fibrillas. Por lo tanto, Cur podría ser utilizado como el agente de detección de fluorocromo más rentable, simple y rápido para placas A.

Etiquetas de curcumina placas A- en un minuto. Cuando teñimos el tejido 5xFAD con Cur, encontramos que las placas de la etiqueta Cur A en 1 min. Aunque el aumento del tiempo de incubación con Cur aumentó ligeramente la intensidad de fluorescencia de las placas de A, el número de placas observadas de A, no fue significativamente diferente entre 1 min y 5 min de tiempo de tinción(Figura 1).
Cur p...

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Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

La curcumina es un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de proteína beta amiloide en el tejido cerebral debido a su unión preferencial a la proteína beta amiloide, así como sus similitudes estructurales con otros colorantes de unión amiloide tradicionales. Se puede utilizar para etiquetar e imágenes de placas de proteína beta amiloide de manera más eficiente y económica que los métodos tradicionales.

Etiquetado e imágenes de placas amiloideas en el tejido cerebral utilizando la curcumina de polifenoles naturales

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Este protocolo es el método más eficiente y rentable para etiquetar con precisión las placas beta-amiloide, en comparación con los anticuerpos específicos de amiloide, que actualmente son el estándar de oro para etiquetar estas placas. Esta técnica toma menos tiempo y es tan eficaz como cualquiera de los métodos de etiquetado amiloide comúnmente utilizados. La curcumina se une fuertemente a las placas amiloideas y se puede utilizar como una sonda de imágenes durante las exploraciones por PET del cerebro y para exámenes relativamente no invasivos utilizando el escaneo de la retina.La curcumina también se une a la maraña neurofibrilaria o tau en la enfermedad de Alzheimer, alfa sinucleína en la enfermedad de Parkinson, y proteínas mutantes de Huntington en la enfermedad de Huntington. Demostrando el procedimiento con Panchanan Maiti serán Zackary Bowers, una estudiante graduada, y Alexandra Plemmons, una científica de investigación de mi laboratorio. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del dolor en un ratón modelo de la enfermedad de Alzheimer anestesado de 12 meses de edad, coloque el ratón en la posición supina en una bandeja de cirugía y haga una incisión en el abdomen y a través del diafragma.Inserte una aguja de perfusión de calibre 21 en la incisión y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir que el líquido de perfusión drene del cuerpo. Utilice un sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir que el líquido PBS molar de 0,1 frío fluya hacia la aguja durante cinco a seis minutos a un caudal de 20 a 25 mililitros por minuto. Si la perfusión se realiza correctamente, se observará un hígado claro.Una perfusión animal adecuada es esencial porque si la sangre no se elimina por completo, la curcumina puede unirse a los vasos sanguíneos y dar lugar a una señal de fondo fluorescente verde. Cuando se haya entregado todo el PBS, cambie la válvula tampón a una solución de 4%paraformaldehído helada durante ocho a 10 minutos antes de usar tijeras y fórceps para liberar el cerebro del cráneo. Luego usa una espátula para colocar el cerebro en un vial de 4%paraformaldehído al menos 10 veces el volumen tisular durante cuatro grados de almacenamiento celsius hasta su procesamiento.Para obtener secciones para la sección de criostatos, sumerja secuencialmente el cerebro en soluciones de sacarosa calificadas a cuatro grados centígrados durante 24 horas por concentración antes de usar un criostato a 22 grados celsius negativos para obtener secciones de 40 micrómetros, colocando de 10 a 20 secciones por pozo en una placa de seis pozos que contiene PBS complementada con 0,02% de azida a medida que se obtienen. Una vez adquiridas todas las muestras, almacene las secciones en cuatro grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para obtener secciones para la sección de parafina, deshidratar el tejido cerebral postfimétrico con soluciones de alcohol grados secuenciales durante dos horas por concentración, seguido de dos inmersiones de una hora 100%alcohol y dos inmersiones de xileno de una hora a temperatura ambiente.Después de la última inmersión en xileno, penetra el tejido con una solución de uno a uno de xileno a parafina dos veces durante una hora por incubación a 56 grados centígrados en un vidrio cónico de vidrio cubierto con papel de aluminio antes de sumergir los tejidos en parafina de 56 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Al final de la incubación, utilice un microtomo rotativo a temperatura ambiente para obtener secciones de cinco micrómetros de espesor colocando las secciones en un baño de agua de tejido celsius de 45 grados centígrados a medida que se recogen. Para el etiquetado de la curcumina de placas beta amiloideas en secciones de tejido criostato, enjuague las secciones con PBS tres veces durante cinco minutos por lavado antes de sumergir las secciones en 70%etanol durante dos minutos a temperatura ambiente.Mientras que las secciones están incubando, disolver un mililitro de curcumina en metanol y diluir la solución a una concentración de trabajo final de 10 micromolares con 70%etanol. Al final de la incubación, sumergir las secciones en la solución de curcumina de trabajo durante 10 minutos a temperatura ambiente a 50 rotaciones por minuto. Al final del período de tinción, desechar la solución de curcumina y lavar las secciones con tres lavados de dos minutos en 70%etanol.Después del último lavado, transfiera las secciones a diapositivas de vidrio recubiertos de poli lisina y monte un resbalón de cubierta en cada diapositiva con un medio de montaje orgánico adecuado. A continuación, vea las secciones de un microscopio de florescencia utilizando un objetivo de 10 o 20x y los filtros de excitación y emisión adecuados. Para el etiquetado histoquímico de secciones de tejido parafinanizado profundo, sumerja las secciones de cinco micrómetros de espesor en xileno dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente por inmersión, seguida de rehidratación con inmersiones de solución de alcohol de un minuto.Al final de la incubación, lavar las secciones con soluciones de alcohol grado durante dos minutos por concentración seguido de claro con dos inmersiones de xileno de cinco minutos. Después de la segunda inmersión en xileno, monte cada sección en un portaobjetos con un resbalón de cubierta y un medio de montaje adecuado para la microscopía de florescencia, como se ha demostrado. Para el etiquetado de muestras de sección criostata con anticuerpos anti-A-beta, lave las muestras tres veces con PBS fresco por lavado en pozos individuales de una placa de 12 pozos antes de bloquear cualquier unión no específica con un suero de cabra 10% normal en PBS y 0.5%tritón x-100 durante una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación, deseche la solución de bloqueo e incubar las muestras con anticuerpos específicos de beta durante la noche a cuatro grados centígrados y 150 rotaciones por minuto. A la mañana siguiente, lave las secciones con tres lavados de 10 minutos en PBS fresco por lavado, seguido de incubación con un anticuerpo secundario adecuado conjugado con un fluoróforo rojo durante una hora a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, lave las secciones tres veces con PBS seguido de un lavado con 70% de alcohol.Después del lavado con alcohol, incubar las secciones con 10 micromolares de curcumina durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de tres lavados de alcohol de un minuto 70%. Después del último lavado, deshidrata las secciones con 90% y 100%alcohol durante un minuto por concentración y despeja las secciones dos veces durante cinco minutos por inmersión con xileno fresco por incubación. A continuación, monte e imagen las secciones como se muestra.Para la co-localización beta amiloide intracelular, mancha las secciones con anticuerpos beta anti amiloide seguidos de tinción con curcumina a temperatura ambiente y 50 rotaciones por minuto protegidas de la luz como se ha demostrado. Al final de la incubación, contramancha con un tinte nuclear adecuado durante 10 minutos a temperatura ambiente y 50 rotaciones por minuto protegidas de la luz seguidas de tres lavados en PBS. A continuación, monte e imágenes de las secciones por microscopía de fluorescencia como se ha demostrado.Aunque aumentar el tiempo de incubación con la curcumina aumenta ligeramente la intensidad de la fluorescencia de las placas beta A, el número de placas observadas no es significativamente diferente entre uno y cinco minutos de tiempo de tinción. La curcumina se puede utilizar para manchar A placas beta y criosectados, parafina incrustada, y muestras de tejido de la enfermedad de Alzheimer humana. Etiquetado con un anticuerpo específico beta antes de la tinción de curcumina revela que la curcumina está completamente co-localizado con A beta en las mismas placas que unen el anticuerpo.Después de la tinción con curcumina etiquetada A beta oligómeros, co-localización de la curcumina con los oligómeros se puede observar en placas beta A. Del mismo modo, la curcumina también co-localiza con el anticuerpo específico A beta en espacios intracelulares, confirmando que la mancha puede etiquetar intracelular A beta. Etiquetado de curcumina también es más prominente que los tintes de unión amiloides convencionales.Derivados de la curcumina encontrados en extractos tumericos etiqueta A placas beta comparativamente a la curcumina en el tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer humana independientemente del tipo de medio de montaje utilizado. Además, señales de inmunofluorescencia de curcumina y contratente intensidad se mantienen incluso después de la tinción con manchas nucleares típicas y otros marcadores celulares. Nos encontramos con que las secciones constantes deben ser más delgadas que 40 micras.Este procedimiento de entrenamiento debe mantenerse por debajo de 30 minutos y la concentración óptima de curcumina es de uno a dos micromolares. Los biomarcadores retardados de doble nivel se pueden realizar en el mismo tejido y pueden proporcionar una mayor especificidad de qué tipos de células cerebrales se están nivelando. Dado que la curcumina puede reducir la carga de la placa amiloide, los mecanismos precisos de cómo se produce este proceso se está investigando actualmente a nivel celular y molecular.

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

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