Name: labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin
Uploaded: 2019-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin at JoVE.com

Bu çalışma için destek St Mary's Yükselişi Alan Nörobilimler Enstitüsü geldi.

Burada açıklanan tüm yöntemler Saginaw Valley State University Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. İnsan dokusu Arizona Banner Sun Sağlık Enstitüsü'nde kurulmuş bir beyin bankası elde edildi15,16.
1. Hayvanların perfüzyonu
<ol><li>Fiksatif ve perfüzyon tamponlarını hazırlayın.<ol>
<li>80 g sodyum klorür (NaCl), 2 g potasyum klorür (KCl), 21,7 g disodyum hidrojen fosfat (Na...

<ol>
	<li>Cummings, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).</li><li>Jack, C. R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarker+modeling+of+Alzheimer's+disease.">Biomarker modeling of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).</li><li>Tarawneh, R., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+problem+of+symptomatic+Alzheimer+disease+and+mild+cognitive+impairment.">The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+protein+misfolding:+the+examples+of+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).</li><li>Hardy, J., Allsop, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposition+as+the+central+event+in+the+aetiology+of+Alzheimer's+disease.">Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).</li><li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+curcumin+in+diagnosis,+prevention,+and+treatment+of+Alzheimer's+disease.">Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease.</a> Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).</li><li>Maiti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+dietary+curcumin,+nanocurcumin,+and+other+classical+amyloid-binding+dyes+for+labeling+and+imaging+of+amyloid+plaques+in+brain+tissue+of+5x-familial+Alzheimer's+disease+mice.">A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Curcumin,+a+Natural+Polyphenol+for+Targeting+Molecular+Pathways+in+Treating+Age-Related+Neurodegenerative+Diseases.">Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).</li><li>Maiti, P., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Neuroprotective+Effects+of+Dietary+Curcumin+and+Solid+Lipid+Curcumin+Particles+in+Cultured+Mouse+Neuroblastoma+Cells+after+Exposure+to+Abeta42.">Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).</li><li>den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+curcumin+forms+selectively+bind+fibrillar+amyloid+beta+in+post+mortem+Alzheimer's+disease+brains:+Implications+for+in-vivo+diagnostics.">Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).</li><li>Koronyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+amyloid+pathology+and+proof-of-concept+imaging+trial+in+Alzheimer's+disease.">Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease.</a> JCI Insight. 2 (16), (2017).</li><li>Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+in+the+retina:+imaging+retinal+abeta+plaques+for+early+diagnosis+and+therapy+assessment.">Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment.</a> Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).</li><li>Koronyo-Hamaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+amyloid+plaques+in+retinas+from+Alzheimer's+patients+and+noninvasive+in+vivo+optical+imaging+of+retinal+plaques+in+a+mouse+model.">Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model.</a> NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).</li><li>Ran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+and+testing+of+difluoroboron-derivatized+curcumins+as+near-infrared+probes+for+in+vivo+detection+of+amyloid-beta+deposits.">Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).</li><li>Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sun+Health+Research+Institute+Brain+Donation+Program:+Description+and+Experience,+1987-2007.">The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007.</a> Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).</li><li>Green, S. J., Killiany, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subregions+of+the+inferior+parietal+lobule+are+affected+in+the+progression+to+AD.">Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD.</a> Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).</li><li>Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+has+potent+anti-amyloidogenic+effects+for+Alzheimer's+beta-amyloid+fibrils+in+vitro.">Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro.</a> Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).</li><li>Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+labels+amyloid+pathology+in+vivo,+disrupts+existing+plaques,+and+partially+restores+distorted+neurites+in+an+Alzheimer+mouse+model.">Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model.</a> Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).</li><li>Mutsuga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+curcumin+to+senile+plaques+and+cerebral+amyloid+angiopathy+in+the+aged+brain+of+various+animals+and+to+neurofibrillary+tangles+in+Alzheimer's+brain.">Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).</li><li>Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+curcumin+to+various+types+of+canine+amyloid+proteins.">The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).</li><li>Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+amyloid+beta+protein+misfolding+and+fibrillogenesis+by+a+lipid+oxidation+product.">Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product.</a> Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).</li><li>Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Congo+red+to+amyloid+protofibrils+of+the+Alzheimer+Abeta(9-40)+peptide+probed+by+molecular+dynamics+simulations.">Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).</li><li>Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+binding+modes+of+Congo+red+to+amyloid+protofibril+surface+observed+in+molecular+dynamics+simulations.">Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).</li><li>Gutierrez, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Method+to+Detect+Neuronal+Degeneration+and+Amyloid+beta+Accumulation+in+Free-Floating+Brain+Sections+With+Fluoro-Jade.">Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade.</a> ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+formation+of+amyloid+beta+oligomers+and+fibrils,+binds+plaques,+and+reduces+amyloid+in+vivo.">Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).</li></ol>

Hipotezimiz, Cur'un diğer klasik amiloid bağlayıcı boyalarla karşılaştırıldığında postmortem AD beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemenin ve iletmenin en hızlı, en kolay ve en ucuz yolu olarak kullanılabileceğini ve aβ'ya özgü antikorlar olabileceğini ileri sürüyordu. Bu çalışmanın amacı, Postmortem AD beyin dokusunda Cur tarafından Aβ plaklarının etiketlenip görüntülemesi için gereken minimum süreyi belirlemek ve Cur'un Aβ plaklarını etiketlemek için Aβ antikora alternatif...

Alzheimer hastalığı (AD) en yaygın biridir, yaşa bağlı, ilerleyici nörolojik bozukluklar ve ölüm önde gelen nedenlerinden biri dünya çapında1,2. Öğrenme, hafıza ve biliş bozukluğu, nöropsikiyatrik bozukluklar ile birlikte, yaygın belirtiler AD3tezahür vardır. AD'nin etiyolojisi tam olarak açıklanmamakla birlikte, mevcut genetik, biyokimyasal ve deneysel kanıtlar Aβ'nın kademeli birikiminin AD4için kesin bir biyobelirteç olduğunu göstermektedir. Bu yanlış katlanmış protein hücre içi ve hücre dışı alanlarda birikir ve sinaptik kaybı dahil olduğu düşünülmektedir, artan nöroinflamasyon, ve beyinde kortikal ve hipokampal bölgelerde nörodejenerasyon AD etkilenen5. Bu nedenle, AD dokusunda Aβ histochemical tespiti AD ilerlemesini önlemek için toksik olmayan, anti-amiloid ilaçların geliştirilmesinde önemli bir ilk adımdır.
Son birkaç on yıl içinde, birçok araştırma laboratuarı tarafından beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemek ve görüntülemek için çeşitli boyalar ve antikorlar kullanılmıştır, ancak bu yöntemlerden bazıları zaman alıcıdır ve kullanılan boyalar veya antikorlar pahalıdır ve birkaç aksesuar gerektirir. Kimyasal. Bu nedenle, AD beyninde Aβ plakların tespit ucuz bir araç geliştirilmesi hoş bir yeni araç olacaktır. Birçok laboratuvar cur kullanmaya başladı, umut verici bir anti-amiloid doğal polifenol, etiketleme ve görüntüleme Aβ için, yanı sıra AD için bir terapötik ajan6,7,8,9. Hidrofobikliği ve lipofilik yapısı, klasik amiloid bağlayıcı boyalarla yapısal benzerlikleri, güçlü floresan aktivitesi ve Aβ ile bağdaştırılan güçlü yakınlığı, Aβ dokudaki Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofon yapar10 . Aβ-plaklar ve oligomerler ile cur bağlanır ve varlığı da hücre içi alanlarda tespit edilir7,11,12,13. Buna ek olarak, bu minimal miktarda (1−10 nM) Cur 5x ailesel Alzheimer hastalığı (5xFAD) beyin dokusu nda Aβ plaklar etiket olabilir gösterilmiştir7. 1 nM konsantrasyonu Aβ plakların sayımı için optimum floresan yoğunluğunu sağlamasa da, 10 nM veya daha yüksek cur konsantrasyonu yapar. Ran ve meslektaşları14 gibi düşük dozlarda 0.2 nM difluoroboron-türevleştirilmiş Cur olarak yaklaşık bir kızılötesi prob in vivo Aβ mevduat tespit edebilirsiniz bildirdi. Bu dozun dokudaki Aβ plaklarını etiketlemek için yeterli olup olmadığı henüz belli değildir. Daha önceki çalışmaların çoğunda Cur kullanarak Aβ plaklarını boyamak için 20−30 dk kullanılmıştır, ancak optimal boyama çok daha az zaman gerektirebilir.
Bu çalışma, Cur'un AD beyin dokusundaki Aβ plaklarını etiketlemek için gerekli olduğu minimum süreyi test etmek ve Cur ile diğer konvansiyonel ile boyandıktan sonra 5xFAD farelerinden beyin dokusundaki Aβ plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi hassasiyetini karşılaştırmak için tasarlanmıştır. Thioflavin-S (Thio-S), Kongo kırmızısı (CR) ve Floro-yeşim C (FJC) gibi aβ bağlayıcı boyalar. Bu klasik amiloid bağlayıcı boyaların Aβ etiketleme yeteneği, 5xFAD farelerinden parafin gömülü ve kriyostat koronal beyin kesitlerinde ve yaşlı uyumlu insan AD ve kontrol beyin dokusundan Cur boyama ile karşılaştırıldı. Bulgular, Cur'un Aβ plaklarını Aβ spesifik antikorlara (6E10) benzer ve Thio-S, CR veya FJC'den orta derecede daha iyi bir şekilde etiketlediğini göstermektedir. Buna ek olarak, 5xFAD fareler için Cur intraperitoneal enjeksiyonları 2−5 gün boyunca uygulandığında, kan-beyin bariyerini geçti ve Aβ plaklar ile bağlı7. İlginçtir, Cur nanomolar konsantrasyonları etiketleme kupuran ve görüntü Aβ plaklar 5xFAD beyin dokusu7,14. Ayrıca, çekirdek, neuritik, diffüz ve yanmış plaklar gibi morfolojik olarak farklı Aβ plaklar Cur tarafından diğer konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalardan daha verimli olarak etiketlenebilir7. Genel olarak Cur, Ad hayvan modellerinden ve/veya insan AD dokusundan postmortem beyin dokusundaki Aβ plaklarını, Aβ'ya özgü antikorlara güvenilir bir alternatif olarak kolay ve ucuz bir şekilde etiket ve görüntü ye uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>IHC world, Woodstock, MD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aanimal model of Alzheimer&#39;s disease</td>
			<td>Jackson&#39;s laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594</td>
			<td>Santacruz Biotech, Dallas, TX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 6E10</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody A11</td>
			<td>Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound light microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo red</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>GMI, Ramsey, MN</td>
			<td>LeicaCM1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystyrene plasticizer xylene</td>
			<td>BDH, Dawsonville, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter papers</td>
			<td>Fisher scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33342</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Leica, Buffalo Grove, IL</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Japan</td>
			<td>Olympus 1x70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ploy-lysine coated charged glass slide</td>
			<td>Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>EMD Millipore, Burlington, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin-S</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR,Radnor, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue using the natural polyphenol curcumin

Amiloid beta proteininin (Aβ) ekstra ve hücre içi alanlarda birikintisi Alzheimer hastalığının (AD) ayırt edici patolojilerinden biridir. Bu nedenle, AD beyin dokusunda Aβ varlığının tespiti AD ilerlemesini önlemek için yeni tedaviler geliştirmek için değerli bir araçtır. Ad beyin dokusunda Aβ histokimyasal olarak saptanmak için çeşitli klasik amiloid bağlayıcı boyalar, florokrom, görüntüleme probları ve Aβ'ya özgü antikorlar kullanılmıştır. Aβ tespiti için bu bileşiklerin kullanımı maliyetli ve zaman alıcıdır. Ancak, yoğun floresan aktivitesi, yüksek afinite ve Aβ özgüllüğü ve geleneksel amiloid bağlayıcı boyalar ile yapısal benzerlikler nedeniyle, curcumin (Cur) postmortem aβ plakların etiketlenmesi ve görüntülenmesi için umut verici bir adaydır beyin dokusu. Bu bitki Curcuma longadoğal bir polifenol olduğunu. Bu çalışmada Cur, 5x ailesel Alzheimer hastalığının genetik fare modeli (5xFAD) ve insan AD dokusundan bir dakika içinde aβ plaklarını histokimyasal olarak etiketlemek için kullanılmıştır. Cur'un etiketleme yeteneği, tioflavin-S (Thio-S), Kongo kırmızısı (CR) ve Floro-yeşim C (FJC) gibi geleneksel amiloid bağlayıcı boyalarla ve Aβ'ya özgü antikorlarla (6E10 ve A11) karşılaştırıldı. Cur'un bu geleneksel boyalarla karşılaştırıldığında Aβ plaklarını etiketlemenin ve imajanın en ucuz ve en hızlı yolu olduğunu ve Aβ'ya özgü antikorlarla karşılaştırılabilir olduğunu gözlemledik. Buna ek olarak, Cur oligomerler ve fibriller gibi çoğu Aβ türü ile bağlanır. Bu nedenle Cur, Aβ plakları için en uygun maliyetli, basit ve hızlı florokrom algılama ajanı olarak kullanılabilir.

Curcumin bir dakika içinde Aβ plakları etiketler. Cur ile 5xFAD dokusunu boyadığımızda, Cur etiketia Aβ plaklarının 1 dk içinde olduğunu bulduk. Cur ile artan kuluçka süresi Aβ plaklarının floresan yoğunluğunu biraz artırsa da, gözlenen Aβ plaklarının sayısı 1 dk ile 5 dk boyama süresi arasında anlamlı olarak farklı değildi(Şekil 1).
Cur, aβ plaklarını kriyostat-ha...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin at JoVE.com

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Kurkumin, amiloid beta proteinine tercihli bağlanması ve diğer geleneksel amiloid bağlayıcı boyalarla yapısal benzerlikleri nedeniyle beyin dokusundaki amiloid beta protein plaklarının etiketlenmesi ve görüntülenmesi için ideal bir florofordur. Amiloid beta protein plaklarını geleneksel yöntemlere göre daha verimli ve ucuz bir şekilde etiketlemek ve hayal etmek için kullanılabilir.

Doğal Polifenol Curcumin Kullanarak Beyin Dokusunda Amiloid Plakların Etiketlenmesi ve Görüntülenmesi

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Bu protokol, şu anda bu plakların etiketlanmasında altın standart olan amiloid spesifik antikorlarla karşılaştırıldığında, beta-amiloid plakları doğru bir şekilde etiketlemek için en etkili ve uygun maliyetli yöntemdir. Bu teknik daha az zaman alır ve yaygın olarak kullanılan amiloid etiketleme yöntemleri nin herhangi biri kadar etkilidir. Curcumin güçlü amiloid plaklar bağlanır ve beynin PET taramaları sırasında bir görüntüleme prob olarak kullanılabilir ve retina taraması kullanarak nispeten noninvaziv taramaları için.Curcumin ayrıca Alzheimer hastalığında nörofibrillary veya tau tangle bağlanır, Parkinson hastalığında alfa sinüklein, ve Huntington hastalığında mutant Huntington proteinleri. Panchanan Maiti ile prosedürü gösteren Zackary Bowers, bir lisansüstü öğrenci ve Alexandra Plemmons, benim laboratuvar bir araştırma bilim adamı olacaktır. Anestezi 12 aylık Alzheimer hastalığı model fare ağrı refleks yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, bir ameliyat tepsisinde supine pozisyonda fare yerleştirin ve karın içine bir kesi yapmak ve diyafram yoluyla.Kesiye 21 gauge perfüzyon iğnesi yerleştirin ve perfüzyon sıvısının vücuttan boşalmasını sağlamak için sağ auricle'da küçük bir kesi yapın. Buz soğuğu 0,1 molar PBS sıvısının dakikada 20 ila 25 mililitre lik bir hızda beş ila altı dakika boyunca iğneye akmasını sağlamak için yer çekimiyle beslenen perfüzyon sistemini kullanın. Perfüzyon doğru yapılırsa, net bir karaciğer gözlenecektir.Kan tamamen çıkarılmaz, çünkü uygun bir hayvan perfüzyonu esastır, kurkumin kan damarlarına bağlı olabilir ve yeşil floresan arka plan sinyali neden olabilir. Tüm PBS teslim edildiğinde, beyni kafatasından kurtarmak için makas ve forseps kullanmadan önce tampon valfi 8 ila 10 dakika boyunca buz gibi %4 paraformaldehit çözeltisine geçirin. Sonra işleme kadar dört derece santigrat depolama için doku hacminin en az 10 katı doku hacmi% 4 paraformaldehit bir şişe içine beyin yerleştirmek için bir spatula kullanın.Kriyostat kesitleri elde etmek için, 40 mikrometre kesitelde etmek için negatif 22 santigrat derecede kriyostat kullanmadan önce konsantrasyon başına 24 saat boyunca dört derece sakaroz çözeltilerinde beyni sırayla daldırın ve elde edilen %0,02 azit ile desteklenen PBS içeren altı kuyu plakasına 10 ila 20 bölüm yerleştirin. Tüm numuneler elde edildiğinde, bölümleri daha fazla işleme alınana kadar dört derece saklayın. Parafin kesiti için kesitler elde etmek için, konsantrasyon başına iki saat sıralı dereceli alkol çözeltileri ile sabit perfüzyon beyin dokusu dehydrate, iki bir saat 100% alkol daldırma ve oda sıcaklığında iki bir saat ksilen daldırma izledi.Son ksilen daldırma sonra, dört ila altı saat boyunca 56 derece santigrat parafin dokuları daldırma önce alüminyum folyo ile kaplı bir cam konik cam 56 santigrat derece kuluçka başına bir saat için parafin çözeltisi için bir-bir ksilen ile doku nüfuz. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında bir döner mikrotom kullanarak, bölümleri 45 derecelik doku su banyosuna yerleştiren beş mikrometre kalınlığında kesit elde edin. Kriyostat doku bölümlerinde amiloid beta plaklarının curcumin etiketlemesi için, oda sıcaklığında iki dakika boyunca %70 etanol deki bölümleri daldırmadan önce, yıkama başına beş dakika boyunca PBS ile bölümleri üç kez durulayın.Bölümler kuluçka yadaken, metanol stok curcumin bir milimolar eritmek ve% 70 etanol ile 10 mikromolar son çalışma konsantrasyonu için çözelti seyreltmek. Kuluçka sonunda, çalışma curcumin çözeltisi içinde 10 dakika oda sıcaklığında dakikada 50 rotasyon larda bölümleri batırın. Boyama periyodunun sonunda, kurkumin çözeltisini atın ve %70 etanolde üç iki dakikalık yıkama ile bölümleri yıkayın.Son yıkamadan sonra, bölümleri polilizin kaplı cam kaydıraklara aktarın ve uygun bir organik montaj ortamı ile her slaytüzerine bir kapak fişi yerleştirin. Daha sonra 10 veya 20x hedefi ve uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanarak floresan mikroskop üzerindeki bölümleri görüntüleyin. Derin parafinize doku bölümlerinin histokimyasal etiketlemesi için, beş mikrometre kalınlığındaki kesitleri her daldırma oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki kez ksilen içine daldırın, ardından bir dakikalık alkol solüsyonu daldırmalarla rehidrasyon devam edin.Kuluçka sonunda, konsantrasyon başına iki dakika dereceli alkol çözeltileri ile bölümleri yıkayın ve ardından iki beş dakikalık ksilen daldırma ile temizleyin. İkinci ksilen daldırma sonra, bir kapak kayma ve floresan mikroskop görüntüleme için uygun bir montaj ortamı ile bir mikroskop slayt her bölümü monte gösterildiği gibi. Kriyostat kesit örneklerinin anti-A-beta antikorlarla etiketlemesi için, pbs'de %10 normal keçi serumu ve oda sıcaklığında bir saat boyunca %0,5 triton x-100 ile spesifik olmayan herhangi bir bağlayıcılığı engellemeden önce numuneleri 12 kuyu plakasının ayrı kuyularında yıkama başına üç kez taze PBS ile yıkayın.Kuluçka sonunda, bloke çözeltisini atın ve numuneleri bir gecede dört derece santigrat derece ve dakikada 150 dönüşle a-beta spesifik antikorile kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, yıkama başına taze PBS üç 10 dakikalık yıkar ile bölümleri yıkayın, uygun bir ikincil antikor ile kuluçka oda sıcaklığında bir saat boyunca kırmızı bir florofor ile konjuge ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, pbs ile üç kez bölümleri yıkayın ve ardından % 70 alkol ile bir yıkama.Alkol yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 mikromolar curcumin ile bölümleri kuluçkaya yatırın ve ardından üç adet bir dakika %70 alkol yıkanır. Son yıkamadan sonra, konsantrasyon başına bir dakika için %90 ve %100 alkol içeren bölümleri kurutun ve kuluçka başına taze ksilen ile daldırma başına beş dakika boyunca bölümleri iki kez temizleyin. Daha sonra bölümleri gösterildiği gibi monte edin ve görüntüleyin.Hücre içi amiloid beta kolokalizasyonu için, anti amiloid beta antikor ile kesitleri leke ve ardından oda sıcaklığında kurkumin ile boyama ve gösterildiği gibi ışıktan korunan dakikada 50 rotasyon. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 10 dakika uygun bir nükleer boya ile karşı leke ve Dakikada 50 dönüşler PBS üç yıkar takip ışıktan korunan. Daha sonra floresan mikroskopi ile bölümleri monte edin ve görüntüleyin.Kurkumin ile kuluçka süresini artırmak A beta plaklarının floresan şiddetini biraz artırsa da, gözlenen plakların sayısı bir ile beş dakikalık boyama süresi arasında anlamlı olarak farklı değildir. Curcumin bir beta plaklar ve kriyosectioned leke için kullanılabilir, parafin gömülü, ve insan Alzheimer hastalığı doku örnekleri. Kurkumin boyama önce A beta spesifik antikor ile etiketleme kurkumin tamamen antikor bağlamak aynı plaklarda bir beta ile birlikte lokalize olduğunu ortaya koymaktadır.Beta oligomer etiketli curcumin ile boyandıktan sonra, a beta plaklarında oligomerlerle kurkumin ko-lokalizasyonu görülebilir. Benzer şekilde, curcumin de hücre içi alanlarda A beta spesifik antikor ile birlikte lokalize, leke hücre içi A beta etiketolabilir doğrulayan. Curcumin etiketleme de konvansiyonel amiloid bağlayıcı boyalar daha belirgindir.Tumeric özleri etiket bulunan curcumin türevleri kullanılan montaj ortamının türüne bakılmaksızın insan Alzheimer hastalığı beyin dokusunda curcumin nispeten bir beta plaklar. Buna ek olarak, curcumin immünoresans sinyalleri ve karşı boyama yoğunluğu bile tipik nükleer lekeler ve diğer hücre belirteçleri ile boyama sonra korunur. Sabit bölümlerin 40 mikrondan daha ince olması gerektiğini gördük.Bu eğitim prosedürü 30 dakika nın altında tutulmalıdır ve optimal curcumin konsantrasyonu 1-2 mikromolar dır. Çift seviyeli geri zekalı biyobelirteçler aynı doku üzerinde yapılabilir ve beyin hücrelerinin hangi tipte tesviye ediliyor daha büyük bir özgüllük sağlayabilir. Kurkuminaaplak plak yükünü azaltabildiği göz önüne alındığında, bu sürecin nasıl oluştuğuna dair kesin mekanizmalar şu anda hem hücresel hem de moleküler düzeyde araştırılmaktadır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Neuroscience

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Amiloid β42 toksisite ve ateş yetişkin Zebra balığı beyinde modelleme

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

FRET tabanlı Sensör ATeam1.03YEMK kullanılarak Fare Beyninin Organotipik Doku Dilimlerinde Hücre İçi ATP'nin Görüntülenmesi

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...