Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

예일 줄기세포 코어(YSCC)와 예일암센터(YCC)에 도움을 주셔서 감사합니다. 그의 신경병리학 적 검토에 대한 김정박사에게 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 재생 의학 연구 기금에 의해 지원되었다, Dimes의 행진, NHLBI R01HL131793 (S.G.), 예일 암 센터와 예일 암 생물학 교육 프로그램 NCI CA193200 (E.B.) 조셉과 루실 매드리.

1. 줄기 세포 유지 보수
<ol><li>H9 hESCs를 성장 인자 감소 층의 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조, 이제부터는 단순히 매트릭스라고 함)에 유지하십시오.<ol>
<li>6웰 플레이트 1개 또는 10cm 접시 1개를 코팅하려면 매트릭스 100 μL과 얼음으로 차가운 덜베코의 수정된 독수리 매체(DMEM)/F12 용지 5.9 mL를 결합합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 초?...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, 이것은 몇 가지 주의 사항이 있는 인공 시스템입니다. 전반적인 발현 수준 면에서 배치 변형에 대한 배치는 거의 없었지만 개별 오르가노이드는 차이를 보였습니다. 예를 들어, Sox-2 양성 영역의 위치는 모든 오르가노이드에서 동일하지않았다(그림 3). qPCR은 세포의 배치에 있는 전반적인 변경을 찾아내기 적당하는 동안, 단세포 RNAseq와 같은 추?...

무수 한 실용적이 고 윤리적제한으로 인해 인간의 뇌를 연구하는 데 많은 어려움이 있었습니다. 설치류를 이용한 연구는 인간의 뇌에 대한 우리의 이해에 중요했지만, 마우스 뇌는 많은비유사성1,2. 흥미롭게도, 마우스는 영장류뇌보다적어도 7배 적은 뉴런 밀도를 가지고3,4. 영장류는 진화적 관점에서 설치류보다 인간에 더 가깝지만 대부분의 연구자들은 그들과 함께 일하는 것은 실용적이지 않습니다. 이 프로토콜의 목적은 뇌 세포 다양성과 세포 조직을 유지하면서 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자를 필요로하지 않고 단순화되고 저렴한 방법을 사용하여 인간 뇌의 많은 중요한 기능을 재량화하는 것이었습니다.
Sasai 실험실에서 조형 작업은 신호화 된 배아 줄기 세포 (ESCs)에서 2 차원 및 3 차원 신경 세포 유형을 생성하는 배아 체의 혈청 무료 배양 법을 사용5,6. 많은 인간의 뇌 오르가노이드 방법은 신호화된 ESCs7,8에서비교적 유사한 경로를 따랐습니다. 대조적으로, 이 프로토콜은 분리된 인간 ESCs(hESCs)의 클러스터로 시작하며, 도금 단계9,10뿐만 아니라 외인성 성장 인자(11)를 첨가하기 전에 파스카 실험실의 뇌 오르가노이드 프로토콜의 초기 단계인 톰슨 및 장 실험실의 정액 작업의 초기 단계와 유사하게 시작한다. 지하막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)는 많은 뇌 오르가노이드 프로토콜에 활용되어 왔으며 효과적인 스캐폴드8로나타났다. 그러나, 가장 일반적으로 사용되는 지하 막 매트릭스는 생산12동안 배치 가변성에 배치와 성장 인자의 알 수없는 수량과 공동 으로 공동 으로 합병증없이 오지 않는다. 또한 이러한 행렬은 이미징을 복잡하게 하고 오염 및 비용의 위험을 증가시킬 수 있습니다.
인간의 뇌 오르가노이드는 많은 질문에 대답하는 데 사용할 수 있지만, 염두에 두어야 할 특정 한계가 있습니다. 하나는, 배아 줄기 세포에서 시작, 오르가노이드는 더 밀접하게 노화 뇌보다 미성숙 한 뇌를 닮은 등 알츠하이머 병과 같은 노년기에 발생하는 질병에 대한 이상적인 모델이 아닐 수 있습니다. 둘째, 우리의 프로토콜은 여러 뇌 영역에서 세포에 대한 치료 또는 질병의 효과를 연구하는 데 유용한 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌 발달의 마커를 발견했지만, 다른 프로토콜은 특정 뇌 영역에 집중하기 위해 따를 수 있다13,14. 마지막으로, 오르가노이드 모델의 또 다른 제한은 크기의 반면, 인간의 뇌의 평균 길이는 약 167 mm, 교반의 사용으로 만든 뇌 오르가노이드는 4mm8까지 성장하고이 프로토콜에 의해 형성 된 오르가노이드는 1-2mm로 10 주까지 증가합니다. 그럼에도 불구 하 고, 이 프로토콜은 인간의 뇌 조직 및 여러 세포 유형의 상호 작용을 연구 하는 중요 한 도구를 제공 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

배아 줄기 세포에서 분화된 인간의 뇌 오르가노이드는 3차원 시스템에서 여러 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서 우리는 두뇌 오르가노이드를 산출하는 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 인간 다능성 줄기 세포는 단일 세포 대신 작은 클러스터로 분해되고 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자없이 기본 매체에서 성장하여 본질적인 발달 단서를 형성할 수 있게 합니다. 오르가노이드의 성장. 이 간단한 시스템은 신경교 세포와 미세 교세포, 줄기 세포 및 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌의 뉴런을 포함한 다양한 뇌 세포 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에서 생성된 오르가노이드는 또한 브라이트필드 이미지, 조직학, 면역형광 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 입증된 적절한 시간및 공간 조직의 특징을 표시합니다. qRT-PCR)을 참조하십시오. 이 오르가노이드는 두뇌의 각종 부분에서 세포 모형을 포함하기 때문에, 그(것)들은 질병의 다수를 공부를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 최근 논문에서 우리는 인간 두뇌에 저산소증의 효력을 공부하기 위한 이 프로토콜에서 생성된 organoids의 사용을 설명했습니다. 이 접근법은 신경 발달 장애, 유전 장애 및 신경질환과 같은 조건을 연구하기 어려운 배열을 조사하는 데 사용될 수 있다.

그림 1은 프로토콜의 여러 단계에서 세포/오르가노이드가 어떻게 생겼는지 를 입증하기 위해 여러 시간 지점의 대표적인 브라이트필드 이미지를 보여줍니다. hESCs를 조직 배양 플레이트에서 제거하고, 작은 조각으로 나누어, 그들이 구체를 형성 하는 T75 초저 부착 플라스크에 배치. 세포는 이 클러스터의 중심에 있는 어둡고 죽어가는 세포 없이, 밝고 유사한 크기에서 보이?...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

인간의 뇌 오르가노이드는 쉽게 조작되고 인간 설정과 다중 세포 유형의 적절한 상호 작용을 통합하는 시스템에서 질병을 연구하는 중요한 도구입니다. 이 기술은 신경 발달 장애, 독성 모욕, 뇌암의 성장과 치료를 포함하여 뇌의 수많은 질병을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 광범위한 뉴런 세포 유형을 가진 매우 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하는 능력입니다.이는 대부분의 실험실에서 수행할 수 있는 매우 단순한 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 그리고 이들은 전문 성장 인자 또는 정의되지 않은 행렬의 영향없이 일시적인 적절한 방식으로 생산되어 매우 간단하고 비용 효율적인 시스템입니다. 시작하려면 100 마이크로리터의 매트릭스와 5.9 밀리리터의 얼음 차가운 덜벡코의 수정된 이글 매체 또는 F12 미디어를 15밀리리터 원추형 튜브에 결합합니다.멤브레인 매트릭스의 1 밀리리터로 6웰 플레이트에 각각 잘 코팅합니다. 접시를 파라핀 필름으로 감싸고 섭씨 4도에서 하룻밤을 보관하십시오. 다음 날, 각 우물에서 과잉 미디어를 흡인, F12와 우물을 헹구고, 잘 당 mTeSR1 미디어의 두 밀리리터의 총 볼륨에 H9 hESCS를 추가합니다.매주 세포를 배양합니다. 매일 2밀리리터의 mTeSR1 미디어를 공급하고 5%의 산소와 5%의 이산화탄소를 가진 섭씨 37도 저산소 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 분화 세포를 제거합니다.매일 미디어를 새로 고칩니다. 세포는 오르가노이드 생산을 위한 H9 세포를 활용하기 전에 4~6일 전에 통과되어야 한다. 세포를 통과하려면 DMEM F12 미디어로 헹구고 과도한 액체를 흡입하여 시작합니다.헹구고, 프로테아제용액을 추가하고 40분 동안 세포를 배양하여 식민지가 우물 내에 떠다닌다. 다음으로, DMEM F12를 사용하여 세포를 세 번 세척하고 필요한 경우 조각을 작게 만들기 위해 적정염을 만듭니다. 그런 다음 세포를 4개의 6웰 플레이트 위에 대략 1-8 비율로 분배하고 배양기안에 판을 놓고 매일 먹일 수 있습니다.4~6일 후에, 세포는 대략 80%의 합류에 도달합니다. 일반 인큐베이터로 전환합니다. 프로테아제스 스톡 솔루션을 hESCS의 각 6웰 플레이트당 DMEM 또는 F12 배지 5밀리리터에 스톡 솔루션 1밀리리터를 추가하여 작업 농도로 희석합니다.흡인 및 세포 배양 매체를 제거한 다음 프로테아제용액으로 hESCS를 덮는다. 플레이트를 인큐베이터에 10-15분 동안 또는 식민지 가장자리가 모이고 매트릭스와 분리되기 시작할 때까지 플레이트를 완전히 반올림합니다. 접시를 기울이고 프로테아제용액을 흡수한 다음, DMEM 또는 F12 2밀리리터로 셀을 세번 부드럽게 세척합니다.식민지가 행렬에 부착되어 있는지 확인합니다. 따라서 ES 세포의 조각이 적절한 크기이므로 적절한 시간 동안 분리되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그들이 너무 짧은 시간 동안 거기에 있다면, 그들을 플러시하고 분해하는 것은 매우 어려울 수 있습니다.그리고 만약 그들이 너무 오래 거기에 있다면, 그들은 실제로 그냥 세척 단계 동안 벗어날 수 있습니다. 신선한 mTeSR 매체의 약 1~1.5 밀리리터를 각 웰에 다시 추가하고 부드러운 파이펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 플러시합니다. 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 플레이트 내에서 hESCS를 흡입하고 분배합니다.이제 식민지 클러스터는 250 ~ 350 마이크로 미터 크기의 조각을 닮았다. bFGF 없이 mTeSR 매체의 30 밀리리터를 포함하는 단일 초저 부착 T75 플라스크로 세포를 전송합니다. 다음 날, 라이브 셀이 모서리에 풀수 있도록 플라스크를 기울입니다.플라스크 의 바닥에 부착 된 세포의 많은 수가있는 경우, 새로운 플라스크에 세포를 전송하는 10 밀리리터 파이펫을 사용합니다. 처음 며칠 동안 죽은 세포의 높은 인구가 있을 것으로 예상. 일단 세포정착, 미디어에 대 한 떠나 미디어와 죽은 세포 떨어져 흡인 10 라이브 세포를 포함 하는 미디어의 밀리 리터와 추가 20 낮은 bFGF 미디어의 밀리 리터 보충 30 bFGF의 밀리 리터 당 나노 그램.이틀 후 셀을 확인합니다. 세포의 대부분은 건강하고 밝은 봐야한다. 그러나, 세포의 3 분의 1 이상이 어두운 나타나는 경우, 플라스크를 기울이고 교체 20 낮은 bFGF 미디어의 밀리리터와 미디어의 밀리리터 20 bFGF의 밀리리터로 보충 20 bFGF의 밀리리터 당 나노 그램.셋째 날에는 미디어의 절반을 제거하고 bFGF의 밀리리터당 10 나노그램으로 보충된 hESC 미디어의 15밀리리터로 대체하십시오. 5일째에는 미디어의 절반을 신경 유도 매체 15밀리리터로 교체하십시오. 그 후, 격일로, 신경 유도 매체로 매체의 절반을 대체합니다.3주 간의 문화가 끝나면 100X 페니실린-스트렙토마이신을 1X의 최종 농도로 미디어에 추가하십시오. 격일로 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 이 프로토콜에서 형성 된 뇌 오르가노이드는 이러한 클러스터의 중심에 어두운 죽어가는 세포없이 크기가 밝고 유사하게 보였습니다.세포는 점차적으로 bFGF 떨어져 짜냈다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드가 시간이 지남에 따라 더 크고 이렇게 어두워졌지만 신경 장미와 같은 구조는 확장되어 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경 관의 특징을 포함합니다.세포 내의 유전자 발현을 보다 심층적인 면모로 보기 위해 qPCR 분석이 수행되었다. 글루타민트 수송기 VLGUT1은 2주 반만에 표현되었고, 5주 만에 증가했으며, 5개월간의 문화를 통해 일관되게 유지되었습니다. 전뇌 마커 Foxg1은 문화권에서 5주까지 낮은 수준으로 표현되었다.깊은 층 마커 Tbr1은 약 5 주 피크와 그 후 감소. 상층 마커 Satb2, 복부 마커 Eng1, 힌드뇌 척수 마커 Hoxb4, 그리고 올리고덴드로시테 마커 Olig2의 발현이 시간이 지남에 따라 모두 증가했습니다. 대조적으로, 줄기 세포 마커 Sox2는 시간이 지남에 따라 감소.신경교 마커 GFAP는 5 주에 정점에 있었고 그 이후에 상대적으로 일정하게 유지되었습니다. 초기 단계 오르가노이드에서 ES 세포를 취급할 때 항생제 없이 자라기 때문에 오염을 피하고 일정에 따라 먹이를 주는 것을 기억하십시오. 이 절차에 따라, 단백질 발현 및 국소화를 위한 유전자 발현 및 면역 형광을 위한 정량적 RT-PCR와 같은 기술을 사용하여 오르가노이드를 평가할 수 있다.이 기술을 사용하여, 우리는 저산소증 챔버에서 모델로 인간 신생아 저산소 상해의 양상을 완화하기 위해 작은 분자의 능력을 연구 할 수 있었다. 이러한 인간의 뇌 오르가노이드가 생체 내 마우스 실험과 유사하게 행동한다는 것은 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

연구

발생학

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

기계론적 연구 및 재생 요법을 향한 강력한 도구로 인간의 치아에서 오가노이드를 확립

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...