Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi takker Yale Stem Cell Core (YSCC), og Yale Cancer Center (YCC) for å få hjelp. Vi takker Dr. Jung Kim for hans nevropatologi gjennomgang. Dette arbeidet ble støttet av Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, og NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center og Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) og en sjenerøs ubegrenset gave fra Joseph og Lucille Madri.

1. Stamcellevedlikehold
<ol><li>Vedlikehold H9 hESCer på et lag med vekstfaktor redusert kjeller membran matrise (se Materialbordet, heretter bare referert til som matrise) i henhold til produsentens instruksjoner.<ol>
<li>For å belegge en 6-brønns tallerken eller en 10 cm tallerken, kombiner 100 μL matrise med 5,9 ml iskald Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) / F12 media. Pakk plater i parafinfilm og oppbevar over natten ved 4 °C. Bruk dem neste dag for å passere celler etter at overflødi...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

I likhet med andre organoidmodeller er dette et kunstig system som kommer med flere advarsler. Selv om det var lite batch til batch variasjon i form av generelle uttrykknivåer, individuelle organoider viste forskjeller. For eksempel var plasseringen av Sox-2 positive områder ikke identiske i hver organoid (Figur 3). Mens qPCR er egnet til å se etter generelle endringer i grupper av celler, vil flere teknikker som encellet RNAseq bli brukt i fremtidige studier for å samle inn mer informasjon på celle...

På grunn av utallige praktiske og etiske begrensninger har det vært store problemer med å studere den menneskelige hjernen. Mens studier som bruker gnagere har vært avgjørende for vår forståelse av den menneskelige hjerne, har musehjernen mange ulikheter1,2. Interessant, mus har en nevronal tetthet som er minst 7 ganger mindre enn primat hjernen3,4. Selv om primater er nærmere mennesker enn gnagere fra et evolusjonært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere å jobbe med dem. Formålet med denne protokollen var å rekapitulere mange viktige trekk ved den menneskelige hjerne ved hjelp av en forenklet og billigere metode uten behov for en heterologøs kjellermembranmatrise eller eksogene vekstfaktorer samtidig som hjernecellemangfold og cellulær organisasjon opprettholdes.
Formativt arbeid fra Sasai-laboratoriet brukte serumfri kultur av embryoidorganer (SFEBq) metode for å generere to- og tredimensjonale nevronale celletyper fra signaliserte embryonale stamceller (ESCs)5,6. Mange menneskelige hjerneorganoide metoder har fulgt en relativt lignende vei fra signaliserte ESCs7,8. I motsetning starter denne protokollen med klynger av frittliggende humane ESCer (hESCs), lik de første trinnene i banebrytende arbeid av Thomson og Zhang laboratorier før plating trinn9,10 samt det første trinnet i hjernen organoid protokollen av Pasca laboratoriet før tillegg av eksogene vekstfaktorer11. Kjellermembranmatriser (f.eks. matrigel) har blitt brukt i mange hjerneorganoidprotokoller, og det har vist seg å være et effektivt stillas8. Men, mest brukte kjeller membran matriser kommer ikke uten komplikasjoner som de co-purifisere med ukjente mengder vekstfaktorer med batch til batch variabilitet under produksjon12. I tillegg kan disse matrisene komplisere bildebehandling, og øke risikoen for forurensning og kostnader.
Mens menneskelige hjerneorganoider kan brukes til å svare på mange spørsmål, er det visse begrensninger å huske på. For det første, fra embryonale stamceller, organoider ligner nærmere umodne hjerner enn alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sykdommer som oppstår i alderdommen, som Alzheimers sykdom. For det andre, mens vår protokoll fant markører for forebrain, midbrain og hindbrain utvikling som er nyttige for å studere effekten av en behandling eller sykdom på celler fra flere hjerneregioner i konsert, andre protokoller kan følges for å konsentrere seg om bestemte hjerneregioner13,14. Til slutt, en annen begrensning av organoid modeller er at av størrelse, mens den gjennomsnittlige lengden på en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjerneorganoider laget med bruk av agitasjon vokse opp til 4 mm8 og organoider dannet av denne protokollen vokse til 1-2 mm av 10 uker. Likevel gir denne protokollen et viktig verktøy for å studere menneskelig hjernevev og samspillet mellom flere celletyper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

Menneskelige hjerneorganoider differensiert fra embryonale stamceller gir den unike muligheten til å studere kompliserte interaksjoner av flere celletyper i et tredimensjonalt system. Her presenterer vi en relativt grei og rimelig metode som gir hjerneorganoider. I denne protokollen er menneskelige pluripotente stamceller brutt inn i små klynger i stedet for enkeltceller og dyrket i grunnleggende medier uten en heterologøs kjellermembranmatrise eller eksogene vekstfaktorer, slik at de iboende utviklingssignaler kan forme organoid vekst. Dette enkle systemet produserer et mangfold av hjernecelletyper, inkludert glial- og mikroglialceller, stamceller og nevroner i forhjernen, midbrain og bakhjernen. Organoider generert fra denne protokollen viser også kjennetegn på passende temporal og romlig organisasjon demonstrert av brightfield-bilder, histologi, immunofluorescens og sanntids kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon ( qRT-PCR). Fordi disse organoider inneholder celletyper fra ulike deler av hjernen, kan de brukes til å studere en rekke sykdommer. For eksempel, i en nylig artikkel demonstrerte vi bruk av organoider generert fra denne protokollen for å studere effekten av hypoksi på den menneskelige hjernen. Denne tilnærmingen kan brukes til å undersøke en rekke ellers vanskelige å studere tilstander som neurodevelopmental handicap, genetiske lidelser, og nevrologiske sykdommer.

Figur 1 viser representative brightfield-bilder av flere tidspunkter for å demonstrere hvordan cellene/organoidene ser ut gjennom de forskjellige stadiene av protokollen. HESCs ble fjernet fra vevkulturplaten, brutt i små biter, og plassert i en T75 ultra-lav festekolbe hvor de dannet kuler. Det er viktig å merke seg at cellene ser lyse og like ut i størrelse, uten mørke, døende celler i sentrene i disse klyngene. Cellene ble gradvis avvennet av bFGF. På dag 5 ble de plassert i nevral...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Denne protokollen ble generert som et middel til å produsere hjerneorganoider på en forenklet, rimelig måte uten eksogene vekstfaktorer eller kjellermembranmatrise samtidig som mangfoldet av hjernecelletyper og mange funksjoner i cellulær organisasjon opprettholdes.

En statisk selvrettet metode for å generere hjerneorganoider fra humane embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Humane hjerneorganoider er et betydelig verktøy for å studere sykdom i et system som lett manipuleres og inkorporerer en menneskelig setting og riktig interaksjon av flere celletyper. Denne teknikken kan brukes til å studere mange sykdommer i hjernen, inkludert nevroutviklingsforstyrrelser, giftige fornærmelser, og vekst og behandling av kreft i hjernen. Den største fordelen med denne protokollen er evnen til å generere svært reproduserbare hjerneorganoider med et bredt utvalg av nevronale celletyper.Dette gjøres ved hjelp av en svært forenklet arbeidsflyt som kan oppnås av de fleste laboratorier. Og disse produseres på en midlertidig hensiktsmessig måte uten påvirkning fra spesialiserte vekstfaktorer eller udefinerte matriser som gjør det til et veldig enkelt og kostnadseffektivt system. Til å begynne med kombinerer du 100 mikroliter matrise med 5,9 milliliter iskalde Dulbeccos Modifiserte Eagle Medium eller F12 media i et konisk rør på 15 milliliter.Coat hver brønn i en seks-brønns plate med en milliliter av membranmatrisen. Pakk platen i parafinfilm og oppbevar over natten på fire grader Celsius. Neste dag, aspirer overflødige medier fra hver brønn, skyll brønnene med F12, og tilsett H9 hESCS i et totalt volum på to milliliter mTeSR1-medier per brønn.Kultur cellene fra uke til uke. Forsyn daglig med to milliliter mTeSR1 media og plasser platen i en 37 graders Celsius lavt oksygeninkubator med 5% oksygen og 5% karbondioksid. Bruk glassverktøy til å ta ut differensieringsceller fra kulturen mellom passasjer.Oppdater mediet daglig. Celler bør passeres fire til seks dager før bruk av H9-cellene for organoidproduksjon. For å passere cellene, start med å skylle dem med DMEM F12 media og aspirere overflødig væske.Etter skylling legger du til proteaseløsning og inkuber cellene i 40 minutter for at koloniene skal flyte i brønnen. Deretter vasker du cellene tre ganger ved hjelp av DMEM F12 og om nødvendig titrerer for å gjøre bitene mindre. Fordel deretter cellene med et omtrentlig en-til-åtte-forhold over fire seksbrønnsplater og legg platene i inkubatoren og mat daglig.Etter fire til seks dager når cellene ca. 80 % samløpet. Overfør dem til en vanlig inkubator. Fortynn protease lagerløsningen til en arbeidskonsentrasjon ved å tilsette en milliliter av lagerløsningen til fem milliliter DMEM eller F12 medium per hver seksbrønnsplate av hESCS.Aspirer og fjern cellekulturmediene, og dekk deretter hESCS med proteaseløsningen. Plasser platene i inkubatoren i 10 til 15 minutter eller til kantene på koloniene runde opp og begynner å skille seg fra matrisen, men før de runder helt opp. Vipp platen, aspirer proteaseoppløsningen, og vask forsiktig cellene med to milliliter DMEM eller F12 for hver brønn tre ganger.Pass på at koloniene forblir festet til matrisen. Så det er viktig at bitene av ES-celler er i riktig størrelse, så sørg for at de er i dispase for riktig tid. Hvis de er der inne for kort tid, kan det være svært vanskelig å skylle dem av og bryte dem fra hverandre.Og hvis de er der inne for lenge, kan de faktisk bare komme av under vasketrinnene. Legg tilbake omtrent en til 1,5 milliliter frisk mTeSR-medier til hver brønn og skyll cellene av platen i et 50 milliliter konisk rør ved hjelp av mild pipettering. Aspirer og dispenser hESCS i platen til de når omtrent 1/30 av sin opprinnelige størrelse.Nå ligner koloniklyngene 250 til 350 stykker på mikrometer. Overfør cellene til en enkelt ultra lav vedlegg T75 kolbe som inneholder 30 milliliter mTeSR media uten bFGF. Neste dag vipper kolben slik at de levende cellene basseng i hjørnet.Hvis det er et stort antall celler som har festet seg til bunnen av kolben, bruk en 10 milliliter pipette til å overføre cellene til en ny kolbe. Forvent å ha en høy populasjon av døde celler de første dagene. Når cellene bosette seg, aspirere av media og døde celler forlater ca 10 milliliter av medier som inneholder levende celler og legge til 20 milliliter av lav bFGF media supplert med 30 nanogram per milliliter bFGF.Etter to dager, sjekk cellene. De fleste cellene skal se sunne og lyse ut. Men hvis mer enn en tredjedel av cellene ser mørke, vipp kolben og erstatte 20 milliliter media med 20 milliliter med lav bFGF media supplert med 20 nanogram per milliliter bFGF.På dag tre, fjerne halvparten av media og erstatte med 15 milliliter hESC media supplert med 10 nanograms per milliliter bFGF. På dag fem erstatter du halvparten av mediene med 15 milliliter nevrale induksjonsmedier. Etter det, annenhver dag, erstatte halvparten av mediet med nevrale induksjonsmedier.Etter tre uker i kultur, tilsett 100X Penicillin-Streptomycin til media ved en endelig konsentrasjon på 1X om ønskelig. Oppdater halvparten av mediene annenhver dag. I denne protokollen så de dannede hjerneorganoidene lyse og lignende ut i størrelse uten mørke døende celler i sentrene til disse klyngene.Cellene ble gradvis avvent av bFGF. På dag fem ble de plassert i nevrale induksjonsmedier, og de forble i dette mediet gjennom hele kulturperioden. Selv om organoidene ble større og dermed mørkere over tid, ekspanderte de nevrale rosettlignende strukturene som indikerer initiering av nevrale differensiering og inneholder egenskapene til det embryonale nevralrøret.For å ta en mer grundig titt på genuttrykket i cellene, ble qPCR-analyse utført. Glutamattransportøren VLGUT1 ble uttrykt ved to og en halv uke, økte med fem uker, og forble konsekvent gjennom fem måneder med kultur. En forebrain markør Foxg1 ble uttrykt på lave nivåer til fem uker i kultur.Den dype lagmarkøren Tbr1 toppet seg rundt fem uker og gikk ned senere. Mens uttrykket av det øvre lagmarkøren Satb2, ventralmarkøren Eng1, bakbrain ryggmargsmarkøren Hoxb4, samt oligodendrocyttmarkøren Olig2 alle økte over tid. I motsetning reduserte stamcellemarkøren Sox2 over tid.Glial markør GFAP toppet på fem uker og forble relativt konstant senere. Husk å ta den ytterste forsiktighet når du håndterer ES-celler i tidlig stadium organoider for å unngå forurensning som de dyrkes uten antibiotika og også huske å mate i henhold til tidsplanen. Etter denne prosedyren kan du evaluere organoider ved hjelp av teknikker som kvantitativ RT-PCR for genuttrykk og immunofluorescens for proteinuttrykk og lokalisering.Ved hjelp av denne teknikken var vi i stand til å studere evnen til et lite molekyl for å lindre aspekter av menneskelig neonatal hypoksisk skade som modellert i et hypoksikammer. Det er viktig at disse menneskelige hjerneorganoider oppførte seg på samme måte som in vivo museeksperimenter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En rask og effektiv metode for rensing av endoderm celler generert fra humane embryonale stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering transplantasjon-passer netthinnens Pigment epitel vev avledet fra menneskelige embryonale stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generering og kultur av lingual organoider avledet fra voksen mus smak stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

En forenklet metode for å generere nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Etablering av organoider fra human tann som et kraftig verktøy mot mekanistisk forskning og regenerativ terapi

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...